LncRNA MEG3在维甲酸诱发小鼠腭裂中的作用机制

Retinoic acid (RA) is the bioactive form of vitamin A. Either excess or deficiency of RA leads to various birth defects including cleft palate. We previously found that RA could promote MEG3 transcription in embryonic palatal mesenchymal cells. The silencing of MEG3 gene can significantly promote the proliferation of embryonic palatal mesenchymal cells and block the RA's inhibitory effect on TGF-β /Smad signaling pathway. But the molecular mechanism remains unknown. Due to the critical role of TGF-β/Smad signal pathway in RA-induced cleft palate, we hypothesize that MEG3 may inhibit the proliferation and migration of palatal cells via regulating the key molecules of the TGF-β/Smad signaling pathway, which ultimately leads to the occurrence of cleft palate. To test our hypothesis, we will culture medial edge epithelium cells and embryonic palatal mesenchyme cells which are associated with the palate development，and build RA-induced cleft palate models. Using siRNA knockdown, ectopic expression, and chemical blocking agents etc, we will elucidate the mechanism of LncRNA MEG3 during the process of RA-induced cleft palate in vivo and vitro. This study will provide a new scientific basis for cleft palate prevention.

维甲酸(RA)是维生素A的生物活性形式，缺乏/过量可导致腭裂在内的多种出生缺陷。我们在前期工作中发现，在胎鼠腭突间充质细胞内，RA能够促进MEG3转录表达；MEG3基因的沉默可显著促进细胞的增殖， 阻断RA对TGF-β/Smad信号途径的抑制作用，但其分子机制分子尚不清楚。鉴于TGF-β/Smad信号通路的在RA诱发腭裂中的关键作用，我们推测：在RA诱发腭裂的过程中，MEG3可能通过调节TGF-β/Smad 信号通路中关键分子来抑制腭突细胞增殖、迁移等，进而导致腭裂的发生。为验证此推测，我们选用腭突发育相关的腭突上皮细胞和腭突间充质细胞，建立培养体系；同时构建RA诱导的小鼠腭裂模型；借助基因沉默、过表达及化学阻断剂等手段，从体内外来验证MEG3在维甲酸诱发小鼠腭裂中的作用机制。本研究将为腭裂预防提供新的科学依据。

腭突间充质细胞增殖在腭发生过程中至关重要，小鼠胚胎腭突间充质(mouse embryonic palate mesenchymal，MEPM)细胞增殖受全反式维甲酸(all-trans retinoic acid，atRA)和TGF-β/Smad信号通路的影响。前期研究发现atRA可调节MEPM细胞增殖，外源性TGF-β3可显著拮抗atRA介导的MEPM细胞增殖抑制，这与TGF-β/Smad信号通路的调节密切相关。长链非编码RNA (LncRNA) MEG3被报道可激活TGF-β/Smad信号，从而调控细胞增殖、分化及相关过程。在体内实验中，发现atRA处理(100 mg/kg)促进MEPM细胞中Meg3的上调，并且这种上调与妊娠第13和14天继发腭融合时MEPM细胞增殖的抑制有关。此外，在atRA处理的MEPM细胞中检测到LncRNA Meg3启动子中特定CpG位点的去甲基化，这可能LncRNA上调的原因。atRA处理后Smad信号通路也受到抑制，RNA免疫沉淀分析显示，atRA处理后Smad2可直接与MEPM细胞中的Meg3相互作用。在体外实验中，我们发现atRA处理的MEPM细胞中Meg3的表达显著增加，而TGF-β3处理MEPM细胞可显著抑制Meg3的表达，并拮抗atRA对Meg3的作用。此外，我们发现Meg3靶向作用于Smad2，且atRA处理显著增强了Smad2免疫沉淀样品中的Meg3。Meg3缺失后，atRA对MEPM细胞增殖及TGF-β3依赖蛋白表达的影响消失。因此，我们推测Meg3通过靶向作用于Smad2，介导TGF-β/Smad信号抑制，从而参与RA诱导的MEPM细胞增殖抑制。此研究为腭裂的预防提供了有力的科学依据。