禽传染性支气管炎病毒对H9亚型低致病性禽流感病毒协同致病的分子机制研究

项目组根据前期研究结果提出假说："IBV对H9亚型LPAIV协同致病的分子基础在于IBV编码的病毒蛋白酶可以帮助H9亚型LPAIV完成HA蛋白的剪切，从而增强其对宿主的感染能力。" 拟设计以下实验对该假说进行验证：① 对IBV编码蛋白酶3CLpro和PLpro进行基因工程表达；② 利用兔网织红细胞体外表达系统进行H9亚型AIV HA基因的体外表达，分别添加两种蛋白酶，通过western-blot技术验证蛋白酶对体外表达HA蛋白的剪切能力；③ 用H9亚型AIV感染CEF，在培养液中分别添加两种蛋白酶，比较CPE形成与病毒滴度的差异，以验证IBV蛋白酶能够帮助H9亚型AIV实现感染细胞的过程；④ 用H9亚型AIV人工感染易感SPF鸡的同时，在病毒样品中分别添加两种蛋白酶，比较其与单纯感染H9亚型AIV的试验组之间致病性的差异，以验证IBV蛋白酶与IBV活病毒一样可增强H9亚型AIV的致病性。

项目组根据前期研究结果提出假说：“IBV对H9亚型LPAIV协同致病的分子基础在于IBV编码的病毒蛋白酶可以帮助H9亚型LPAIV完成HA蛋白的剪切，从而增强其对宿主的感染能力。” 但在项目实施的过程中，通过构建3CLpro和PLpro蛋白酶基因真核表达质粒，转染细胞后表达的两种蛋白酶仅能识别天然底物而不能识别H9亚型AIV HA蛋白连接肽序列GSSR/GLF并完成剪切，重组载体转染DF1细胞后在不添加外源性蛋白酶的情况下也不能帮助H9亚型AIV在细胞上进行复制。上述结果说明IBV编码的3CLpro及PLpro均不能对H9亚型AIV HA蛋白进行剪切，从而帮助病毒进行复制，因此此前的假设不成立，需要继续从其他的角度对IBV与H9亚型AIV协同致病的机制进行进一步探索。. 在分析最新文献的基础上，及时调整研究思路，经进一步研究发现：（1）不同的感染顺序对两种病毒协同致病效应存在较大影响，先感染IBV后感染H9亚型AIV所导致的发病更为严重；（2）鸡胚和鸡的感染试验都表明IBV单独感染诱导细胞因子的表达不明显，H9亚型AIV感染后可以诱导一定水平的细胞因子表达，但当IBV与H9亚型AIV感染后AIV病毒载量显著升高，同时诱导多种细胞因子高水平表达，形成“细胞因子风暴”；（3）IBV感染或PLpro蛋白酶单独表达均能通过去泛素化作用机制发挥拮抗I型干扰素应答的功能。对上述结果综合分析认为，IBV可通过抑制感染早期干扰素应答反应促进H9亚型AIV的体内复制，而AIV病毒载量的增加则诱导产生了严重的“细胞因子风暴”，从而导致比单独感染更加严重的临床后果，但该假设需要进一步通过更加系统的实验进行验证。