H9N2亚型禽流感病毒对鸡致病性增强的分子机制

Our previous study found that the pathogenicity of most H9N2 subtype avian influenza virus isolated on chicken was increasing from 2008. However, the mechanism of increased pathogenicity was still unknown. The project was proposed to screen the crucial determinant for the pathogenicity of H9N2 subtype avian influenza virus. Reverse genetic techniques will be used to rescue the viruses, which possessed similar genome and different virulent in chickens.The rescued virus with different pathogenicity will be used to infect the SPF chicken to study their tissue tropism and reproduction. Through the analysis of the viral sequence and the pathogenicity, the mechanism of increasing virulence of the H9N2 virus will be interpreted. These will be benefit for the prevention and control of H9N2 sutype influenza.

临床调查研究发现，自2008年以来H9N2亚型禽流感对养鸡业造成的损失越来越大；实验室前期研究表明，许多H9N2亚型禽流感病毒临床分离株对鸡的致病力明显增强。然而，H9N2亚型禽流感病毒对鸡致病性增强的机制尚不明确。本项目以H9N2亚型禽流感病毒为研究对象，以病毒致病机制为核心内容，通过对病毒基因序列的分析，建立致病性明显不同而基因组遗传背景相似的病毒对，利用反向遗传操作技术，进行影响病毒致病性基因片段及关键氨基酸位点的鉴定，进而揭示H9N2亚型禽流感病毒对鸡致病性增强的分子机制，为H9N2亚型禽流感的预防和控制提供理论支持。

临床发现不同H9N2亚型禽流感病毒分离株引起的鸡的症状大不相同，并且实验室前期数据显示，2007年之后的毒株对鸡的致病性增强。本研究开展H9N2 AIV基因序列测定及特性分析、H9N2 AIV对SPF鸡的致病性研究、影响H9N2 AIV致病性基因片段的鉴定以及影响H9N2 AIV致病性关键氨基酸位点鉴定。通过对18株病毒的全基因序列分析，推断HA受体结合位点的变异以及HA和NA新的糖基化位点的出现可能导致H9N2病毒致病力的改变。通过SPF鸡的致病性实验，证明H9N2病毒的致病力明显增强，并且病毒在鸡体内的组织嗜性越来越广泛。利用反向遗传操作系统，初步鉴定出HA、NS可能是引起H9N2亚型禽流感病毒的致病力增强的片段，并验证了NA茎部三个氨基酸的缺失与HA蛋白序列的A316S突变共同作用可增强HA的裂解效率，增强病毒的致病性。.除申请书预设的研究任务之外，本团队与中国农业大学刘金华教授团队合作，开展了养殖场鸡群禽流感病毒的追溯性流行病学调查，发现G57基因型毒株在2010年之后成优势流行，增强了H9N2病毒参与重排的机会，并为新型H7N9病毒提供了全部6个内部基因。此外，本团队与中国动物卫生与流行病学中心陈继明研究员团队合作，扩大H9N2禽流感流行病学调查的范围，除集约化养殖场外，对多个省份的散养鸡、野鸟、活禽市场进行采样分析，以期从序列来源推导农场鸡、野鸟和散养鸡H9N2的相互关系。先后获得624株H9N2病毒全基因组序列，生物信息分析工作正由高福院士团队成员史卫峰教授在澳大利亚顺利展开，2017年底会有一批成果整理成文。在病毒致病性实验方面，增加了H9N2感染的蛋白质组学分析和细胞因子差异分析，从宿主对不同毒株的差异蛋白表达差异和细胞因子表达差异两方面，探究毒株致病性差异原因。结果发现差异蛋白参与代谢、合成、运输、生物调节和免疫反应等多种重要的生物学过程；不同致病性毒株诱导细胞因子的表达高于对照组，致病力较强毒株诱导肺脏和肾脏细胞因子的表达高于致病力较弱毒株；病毒诱导肺脏和肾脏炎性细胞因子的表达早于抗病毒因子的表达，肠道炎性细胞因子在病毒感染后期表达。