糖基水解酶的碱性羧基末端结构域的功能研究

碱性羧基末端结构域（Basic C-terminal domain, BTD）是瘤胃中主要的纤维素降解细菌的糖基水解酶特有的一个结构域。该结构域位于糖基水解酶的羧基末端，一般由40-80个氨基酸组成，含有较多的碱性氨基酸，结构域的等电点（pI）一般大于10。该结构域的功能现在未知。我们克隆自水牛瘤胃未培养微生物中的5个纤维素酶具有BTD结构域。本项目通过构建BTD结构域的缺失酶和含BTD结构域的杂合酶，比较野生酶和缺失酶、杂合酶的酶学特性的异同来证明BTD结构域的功能，通过BTD结构域的定点突变改变该结构域的等电点构建突变酶，比较野生酶和突变酶的酶学特性差异来研究BTD结构域的作用机理，通过构建含BTD结构域的绿色荧光蛋白与细菌的结合来研究该结构域可能的细胞定位。本项目的实施可以证明瘤胃细菌的糖基水解酶特有的BTD结构域的功能，有助于我们进一步明确瘤胃纤维素降解细菌高效降解纤维素的机制。

本项目目的是鉴定存在于瘤胃细菌的碳水化合物活性酶（Carbohydrate -active enzymes）中未知功能的碱性羧基末端结构域（Basic C-terminal domain，BTD）的功能。BTD都位于酶或蛋白质的羧基最末端，大小为30-80个氨基酸（aa），含有较多的碱性氨基酸，一般该结构域等电点都大于10，目前BTD的功能还未知。本项目通过构建来源于水牛瘤胃未培养微生物的内切葡聚糖酶C5614-1的系列缺失衍生物，发现了该酶的未知功能的羧基末端区域（189aa，包括BTD）是一个新的碳水化合物结合组件（carbohydrate binding mudule, CBM），与其它已知的CBM没有任何同源性。该CBM的特点是具有广泛的底物结合特异性，且该CBM是酶保持对pH和温度稳定性及对不可溶底物降解活性起重要作用。进一步实验发现将CBM的BTD去掉也不影响该CBM的结合能力，说明该BTD并没有参与CBM与多糖的相互作用。将C5614-1和它的同源内切葡聚糖酶C67-1的BTD（羧基最末端的40aa）缺失后，BTD缺失酶与野生酶对pH和温度的稳定性是相似的；将C5614-1与C67-1的BTD与Umcel5K融合后，融合酶与野生酶Umcel5K的pH和温度稳定性也是相似的，说明BTD对酶的酶学特性没有显著的影响。我们通过生物信息学分析了瘤胃的主要纤维素降解细菌Fibrobacter succinogenes的基因组编码的全部蛋白质，有295个蛋白质含有BTD结构域，其中包括很多与植物细胞壁降解有关的酶类，所有BTD结构域进化树分析表明它们分为4个大的分支，20个次分支，它们彼此间的保守性不高，说明BTD结构域具有多样性。我们推测BTD结构域很可能介导了酶与宿主细胞的结合。我们根据BTD的进化树在20个不同分支中各选择一个作为代表，将它们与绿色荧光蛋白（GPF）相连形成融合蛋白，检测了BTD融合蛋白与细胞的结合。该项目丰富了CBM家族的多样性，对BTD的功能鉴定有可能提出一种纤维素降解细菌降解植物细胞壁的新策略。.该项目已基本完成预期的研究计划，研究结果已发表了SCI论文2篇，英文专著一章节,获得一项国家发明专利。培养硕士生4名，其中1人已毕业。