肿瘤-睾丸相关抗原LDHC 166G>A突变促进乳腺癌转移的机制研究

The cancer-testis antigen, lactate dehydrogenase C4 (LDH-C4), is reported to be closely associated with the development and progression of cancers. Notwithstanding, the functional role of LDH-C4 in breast cancer remains unclear. In our previous work, we found that a heterozygous LDHC mutation (166G>A) identified in some breast cancer patients was involved in cancer metastasis. Bioinformatics analysis indicated that the mutation resulted in an impact on the conformation of LDH-C4 tetramer. In vitro study manifested that the wild and mutant C subunits still interact in polymerizing the tetramer (LDH-C4); moreover, this mutation could promote cell metastasis in MCF-7 breast cancer cells, as well as an increase of the secretion of D-lactate. We thus posed an assumed hypothesis that wild and mutant C subunits interact in different patterns in polymerizing the tetramer and alter LDH-C4 conformation, which further influence the catalytic selectivity of LDH-C4 enzyme and generating D-lactate; the production of D-lactate could change tumor microenvironment and finally accelerate cancer progression and metastasis. This study sought to: ① investigate the associations between LDHC 166G>A mutation and breast cancer clinically; ② clarify the functional role of LDHC 166G>A mutation in accelerating breast cancer metastasis in cellular and molecular levels, and finally verify the assumed hypothesis in vivo. Based on the researches above, our study will clarify the underlying mechanisms of LDHC mutation in promoting metastasis in breast cancer, and offer a new way of thinking for individualized diagnosis and treatment of breast cancer.

乳酸脱氢酶C4(LDH-C4)作为一种肿瘤-睾丸相关抗原，与肿瘤的发生和发展相关，但其在乳腺癌中功能尚不清楚。课题前期研究发现，部分乳腺癌患者携带的LDHC 166G>A杂合突变参与肿瘤的转移进程。生物信息学预测该突变导致蛋白空间构象改变；体外实验结果显示突变型和野生型C亚基仍能相互结合形成LDH-C4四聚体，且共转染野生、突变型C亚基质粒的MCF-7乳腺癌细胞侵袭转移和D-乳酸分泌能力均增强。据此我们提出假说：突变型和野生型C亚基相互结合影响形成LDH-C4蛋白的空间构象，致其催化选择性降低，促进细胞产生D-乳酸，改变周围微环境，加速肿瘤的转移。本项目拟：①在临床层面探讨LDHC 166G>A突变与乳腺癌的相关性；②结合生物信息学分析，在细胞和分子层面研究该突变促进乳腺癌转移的机制，并在动物水平加以验证。最终阐明LDHC基因突变参与乳腺癌转移的可能机制，为乳腺癌的个体化诊疗提供新思路。

该项目原计划在临床层面探讨LDHC 166G>A突变与乳腺癌的相关性，并结合生物信息学分析，在细胞和分子层面阐明LDHC 166G>A杂合突变促进乳腺癌转移的机制。项目进展顺利，超额完成了研究内容。 . 该项目在临床层面通过对乳腺癌患者进行基因突变筛查，发现LDHC 166G>A 杂合突变在乳腺癌患者中的突变率很低。此后，我们及时调整课题计划，将研究的重点放到分子机制和野生型LDHC基因功能等方面，发现LDH-C4蛋白在乳腺癌患者中表达阳性率高于90%，且可作为乳腺癌预后的独立预测因子；研究增加了对血清及血清外泌体来源LDHC mRNA表达及临床应用价值的探索（Clin Chim Acta，2020）；研究同时基于公共数据库，增加分析了LDHC基因在乳腺癌中的表达、预后价值，以及 LDHC相关共表达基因和乳腺癌中相关耐药基因的筛查（Transl Cancer Res，2020）。. 该项目在分子机制的研究中，首先从生物信息学角度分析比较 LDHC 166G>A 杂合突变对蛋白二级、三级结构、氨基酸残基之间的距离、酶的空间活性位点等的影响，发现166G>A突变位点正好位于两个酶活性位点之间，此处氨基酸残基的改变可对酶的空间构象产生很大影响，从而增强酶蛋白的催化活性。细胞实验进一步证实野生型C亚基和突变型C亚基仍然可以相互作用，结合形成LDH-C4四聚体酶蛋白，蛋白催化活性较野生型明显增强，并且LDHC 166G>A 杂合突变细胞模型的侵袭转迁移能力明显增强，进一步验证了项目提出的科学假说。关于野生型LDH-C4的研究，我们发现LDH-C4过表达、敲减均影响乳腺癌细胞系的生长增殖、侵袭迁移及能量代谢水平；裸鼠成瘤实验证实了LDH-C4过表达可促进MDA-MB-231细胞的生长和成瘤能力，与细胞水平结果相互印证。项目最后对LDH-C4作为癌-睾丸抗原分子在恶性肿瘤中的研究进展作了梳理和总结（中国癌症防治杂志，2019；中国癌症防治杂志，2020）。项目的完成为进一步认识乳腺癌的侵袭转移机理提供新线索。