短双歧杆菌生物转化共轭亚油酸的分子机理及调控机制

Conjugated linoleic acid (CLA) refers a group of positional and geometric isomers of linoleic acid with conjugated double bond. CLA can be produced by chemical methods, however the products are complex and often mixed with CLA isomers. Lactic acid bacteria (LAB) can produce c9,t11-CLA which have immunity modulation activity. Therefore, biological methods for CLA production has attracted much attention. Bifidobacteria is the most yield of single CLA isomer, unfortunately, its mechanism and regulation for CLA production remains unclear. In this proposal, with a high CLA production strain of Bifidobacterium breve, combined with genomics, metabolomics and transcriptomics and molecular biology methods, we will focus on the functional genes composition, activity and transcription as well as metabolite accumulation to explain the the molecular mechanism and regulation mechanism for CLA production. Information obtained would be helpful for industrial production of CLA, and beneficial evaluation and application of B. breve.

共轭亚油酸（CLA）是从亚油酸衍生出的一类共轭双烯酸异构体的总称。常用化学法合成的CLA产物组成复杂且难以得到单一活性异构体，而乳酸菌能产具免疫调节活性的c9,t11-CLA异构体，因此利用生物法选择性合成CLA活性异构体已成为该领域的研究热点。目前双歧杆菌是已知CLA转化效率最高的微生物，但其转化机理与调控机制尚不清楚。本项目以一株c9,t11-CLA转化率达89%的短双歧杆菌为研究对象，结合基因组学与分子生物学手段，从亚油酸异构酶基因组成与功能以及生物转化通路进行分析，解析其生物转化CLA的分子机理；并运用代谢组学、转录组学等方法，从代谢物积累、基因转录等水平，阐明其生物转化CLA的调控机制，为将乳酸菌遗传改良使其适用于工业化生产CLA提供指导，也为短双歧杆菌的应用奠定重要的物质基础和理论依据。

共轭亚油酸因具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤等功效而对人体健康有重要作用。虽然已有大量文献证实了双歧杆菌具备高产CLA的能力，但双歧杆菌生物转化生成CLA的功能基因及其调控机制仍未知。为了阐述双歧杆菌生物转化CLA的分子机制及调控机制，本研究首先通过同位素13C标记法明确了双歧杆菌CCFM683产CLA的转化途径。进一步通过转录组学、分子生物学等手段技术确认了生物转化CLA的关键基因，并探究了该酶在菌株应对亚油酸胁迫过程中的作用，最后明确了该过程的基因转录调控。主要结果如下：.通过生物信息学方法，并基于转录组学数据，结合WGCNA成功预测了参与共轭亚油酸生物转化的功能基因，并通过分子生物学手段，确认了短双歧杆菌CCFM683中生物转化CLA转化的关键基因是亚油酸异构酶基因bbi，确认了转化生成CLA为单步反应；BBI仅能以游离态亚油酸为底物生成共轭亚油酸，该酶还可催化α-亚麻酸和γ-亚麻酸生成共轭脂肪酸，转化效率从高到低依次：α-亚麻酸、LA、γ-亚麻酸。.基于稳定同位素标记技术示踪生物转化共轭亚油酸的通路，解析短双歧杆菌CCFM683中LA、CLA以及10-HOE的分布，确认了亚油酸对短双歧杆菌CCFM683生长的影响。.分析了短双歧杆菌CCFM683中亚油酸异构酶与亚油酸水合酶的定位，并确定了短双歧杆菌CCFM683亚油酸异构酶与亚油酸水合酶（MCRA）对于菌株耐受游离态LA的胁迫具有非常重要的作用。明确了短双歧杆菌亚油酸异构酶与亚油酸水合酶对底物LA的竞争性。并解析了短双歧杆菌CCFM683生物转化CLA的代谢物调控。.阐明了转录调控蛋白ClgR对短双歧杆菌CCFM683生物转化CLA、10-HOE的影响，该转录调控蛋白可同时调控亚油酸异构酶基因bbi以及亚油酸水合酶基因mcra的转录过程；明确了转录调控蛋白ClgR与bbi以及mcra基因上游调控区域的相互作用、转录调控蛋白ClgR调控bbi以及mcra基因转录的功能区域，以及bbi以及mcra基因上游调控区域与转录调控蛋白ClgR的结合位点。