负载VEGF的磁性量子点结合细胞膜片技术构建组织工程尿道的实验研究

Urethral stricture is a common and frequent disease, and difficult for treating. Simple natural or synthetic materials couldn't offered satisfactory curative effect for long urethral defect, and urethroplasty with large areas of autologous tissues will be limited and lead to interfereing with the wounds' healing. The application of tissue engineering provides more acceptable solution for urethroplasty, but its effect varies considerably and its mechanism is indistinct. It exists more disadvantages with conventional methods of seeding cells onto scaffolds including low cells-availability and inhomogeneous cells-distribution. Based on prior experiment, we will offer more feasible source of seeding-cells for tissue engineering-urethra, adopt cell-sheet technology to construct multilamellar urinary tubulate tissue and use magnetic quantum dots marking seeding-cells to fulfil labeled-cells' tracing study in vivo, combine vascular endothelial growth factor and magnetic quantum dots to enhance the urethra's vascularization. We will implant tissue engineering-urethra to reconstruct auto canine's urethral defect, using of imageology's, biomechanics', histological, immunohistochemical and molecular biological methods to observe seeding-cells' transmutation in vivo, giving initial explanation to how tissue engineering repair urethral defect. This study will provid a new viewpoint and theoretical proof for the clinical application of tissue engineering-urinary tubulate graft.

尿道狭窄是泌尿外科常见和多发病，治疗较为困难，单纯的天然和人工材料修复长段尿道缺损时效果不佳，大面积自体取材修复受到限制且会影响创面愈合。组织工程技术丰富了尿道缺损的治疗手段，但其疗效却差异很大且机制（即种子细胞修复后的转归情况）不清。传统的种子细胞复合支架材料的方法存在细胞利用率低且细胞分布不均等缺点，本研究在前期实验基础上，优化种子细胞的来源，应用细胞膜片技术构建真正意义上的多层次泌尿肌性管腔结构，结合磁性量子点标记技术实现对种子细胞植入后活体转归的示踪研究，并利用该磁性量子点负载血管内皮生长因子提高组织工程化尿道的血管化程度，将体外构建的组织工程化尿道回植于犬体内修复尿道缺损，采用影像学、生物力学、组织学、免疫组织化学与分子生物学等方法，观察其在体内环境中的变化和转归情况，初步阐述组织工程修复尿道的机制，为组织工程化泌尿肌性管腔的临床应用提供新的思路和理论依据。

细胞膜片技术无须支架材料和酶消化，通过刺激细胞外基质分泌形成致密膜片组织，能有效地修复组织缺损和改善器官功能。在本研究中，我们首先制备具有良好磁响应性，分散性好，粒径7nm左右的超微超顺纳米磁性氧化铁（USPIO），采用比格犬作为动物模型，原代培养种子细胞（口腔上皮细胞、口腔成纤维细胞、脂肪干细胞），分别检测USPIO对种子细胞标记效率和细胞毒性，筛选最佳USPIO标记浓度，探讨其磁共振成像（MRI）可行性；其次，利用维生素C刺激并制备相应细胞膜片,其中NIH-3T3作为滋养层细胞培养上皮细胞膜片，5-氮杂胞苷诱导成肌细胞膜片形成；最后，上述三种细胞膜片分别按照上皮层、成纤维层、肌层顺序环绕于2.5cm硅胶管上，并移植腹股沟皮下以促进其生物力学强度和血管化水平，移植3周后取出，全层替代2.0cm长阴茎段尿道，设USPIO标记细胞膜片尿道组、细胞膜片尿道组、SIS修复组，每组6例，尿道替代3个月后行尿道造影和MRI评估尿道修复情况，处死实验动物，行大体观察及组织学检测。研究结果表明，利用适宜浓度的USPIO能有效标记种子细胞和细胞膜片，且细胞活性不受影响，标记后MRI显影良好，在T2加权像下呈现低信号表现，构建细胞膜片具有质地均一，细胞外基质含量丰富，抗牵拉性好，不易破裂等优点。移植皮下3周，力学强度测试表明其具备良好机械强度。全层尿道替代3个月后，尿道造影显示USPIO标记细胞膜片尿道组和细胞膜片尿道组均排尿通畅，SIS修复组全部尿道狭窄和/或尿瘘，标记细胞膜片尿道可在核磁下有效活体示踪。离体组织学分析显示，细胞膜片尿道结构层次与正常尿道相似，包括上皮层和肌层结构。同时免疫荧光染色表明，皮下移植3周后，可观察到细胞膜片尿道中明显微血管生成，体内尿道替代后血管密度进一步增加，接近于正常尿道组织微血管密度（P>0.05）。因此，我们研究在国际上首次证实，利用细胞膜片技术构建仿生尿道可用于全层管状尿道修复与替代，并可被USPIO有效标记和体内示踪，这为临床上全层尿道缺损修复提供新的治疗途径。