探索一种新型、高滴度、无rcAAV污染的rAAV载体规模化制备系统

One of the key factors for successful gene therapy is appropriate gene delivery carrier. Recombinant adeno-associated virus (rAAV) vector is considered to be one of the most promising gene vectors, but the contamination of the existing packaging capacity of the technology and products rcAAV (with replication-competent AAV) has seriously hampered its clinical application. This project proposes a new packaging system VV-Ad/AAV by using complete life cycle in the cytoplasm of vaccinia virus (VV) auxiliary components as the AAV Rep-Cap expression vector, adenovirus-adeno-associated virus (Ad/AAV) heterozygous carrier as supplier of rAAV vector genomes and helper virus genome. Assemble of rAAV vector required all component supplied by virus, not only be infected with the suspended cells, and can simulate the wild-type AAV replication and packaging mechanisms, resulting in efficient, high-quality preparation of the rAAV vector. The VV-Ad/AAV system sequesters the AAV helper genes (Rep-Cap) and the rAAV vector DNA in two different cellular compartments. For the first time the contamination of rcAAV can be completely eliminated by avoiding ubiquitous nonhomologous recombination. This project will prove that the system can be packaged on the basis of the various serotypes of rAAV vector to optimize the system configuration, to achieve the packaging efficiency of 1 × 10E5 vg / cell, thus providing basic information to establish a simple, low-cost packaging process in the future.

基因治疗关键共性之一是合适的基因载体。重组腺相关病毒(rAAV)载体被认为是最有希望的基因载体之一，但现有制备技术的产能不足及产品中存在的rcAAV(具复制能力的AAV)污染严重制约了其临床应用。本项目提出一种全新的制备系统VV-Ad/AAV：采用可在细胞质完成生命周期的痘苗病毒(VV)作为AAV辅助元件Rep-Cap的表达载体，以腺病毒-腺相关病毒(Ad/AAV)杂合载体作为rAAV载体基因组和辅助病毒基因组的提供者。组装rAAV载体所需组分全由病毒提供，不但可感染悬浮细胞，而且可模拟野生型AAV的复制和包装机制，从而高效、高质量的制备出rAAV载体。该系统另外一个优点乃是能从空间上避免基因组重组，阻止rcAAV的产生。本项目将在前期证明该系统可制备各种血清型rAAV载体的基础上，优化系统配置，使包装效率达到1×10E5 vg/cell，为今后建立工艺简便、成本低廉的包装体系奠定基础。

基因治疗的关键在于有合适的基因载体。重组腺相关病毒（rAAV）载体被认为是目前最有希望的基因载体之一，但现有制备技术的产能不足及产品中存在的rcAAV（具有复制能力的AAV）污染严重制约了其临床应用。本项目提出一种全新的制备系统VV-Ad/AAV。痘苗病毒（VV）属于痘病毒家族，是唯一一类能在细胞质中自我复制的DNA病毒。将VV作为AAV辅助基因组，首先，可使Rep-Cap基因组定位在细胞质，而rAAV载体基因组定位于细胞核，这样两者被隔离而不会发生重组，有效避免rcAAV的产生；其次，Rep-Cap基因组定位于细胞质而不进入细胞核，可大大提高cap和rep的表达效率，降低制备过程中所需的VV病毒MOI值。.本项目主要研究VV-Ad/AAV系统的广谱应用性，以及Rep、Cap和AAP在VV-Ad/AAV系统中的作用，还有VV-Ad/AAV系统的配置优化。.不断完善高滴度、高效、经济的rAAV规模化制备工艺，将其应用于VV-Ad系统的大规模生产。我们已在Hela S3中利用该系统成功制备具有高活性的rAAV载体，且没有检测到rcAAV，并对四类Rep基因（Rep78、Rep68、Rep52、Rep40）、三种Cap基因（VP1、VP2、VP3）和AAP在VV-Ad/AAV系统中所起的作用作了系统性研究。逐步推进并优化VV-Ad制备系统。.rAAV 基因药物临床研究的扩大和深入对 rAAV 载体的产量和质量提出了更高要求。本项目提出一种全新的 rAAV 载体制备系统 VV-Ad/AAV。该系统以 VV 提供 AAV 辅助基因组，以 Ad/AAV 杂合载体提供 rAAV 载体基因组和 Ad 辅助基因组。该系统具有以下几个方面的优势：.①全部组分有病毒提供，可通过优化各组分在宿主细胞内表达的时空和量效关系，模拟wtAAV在细胞内的复制和包装机制，高效、高质量的制备出rAAV载体。.②该系统将AAV辅助基因组定为于细胞质，而将rAAV载体基因组定位于细胞核，能从空间上阻止两者重组，避免rcAAV的产生。.③VV病毒可高效表达Rep和Cap，且其自身繁殖不受Rep和Cap基因产物的影响，较低MOI就能制备出rAAV载体，并且其本身可轻易去除，非常经济、高效。