突变型p53蛋白在ALV-J感染与致瘤中的作用及其机制研究

Avian leukosis, caused by avian leukosis virus subgroup J (ALV-J), is the most important infectious tumor disease of poultry in China. Several tumor-related cellular genes are involved during the development of tumor, the mutant p53 gene with high expression is easy to be detected. However the function of mutant p53 protein on the infection and replication of ALV-J and the tumorigenic mechanism remain unknown. Our preliminary study showed mutations and deletions were found in specific sites of p53 gene. In this proposal, mutant-type and wild-type p53 gene will be inserted into eukaryotic expression plasmids and transfected into DF-1 cells, and then the infection and replication of ALV-J caused by two types of p53 proteins will be analyzed and compared. Also the influences on the expression of tumor-related genes, cell cycle and apoptosis. Moreover, the two plasmids will be injected to ALV-J-infected chicks and the uninfected SPF chicks respectively to evaluate and compare the influences on the replication of ALV-J and the tumorigenesis, and then study the molecular pathology mechanisms.

J亚群禽白血病是由J亚群禽白血病病毒（ALV-J）引起的我国目前最常见的一种禽肿瘤性传染病，研究证实宿主体内多种肿瘤相关基因参与该病的发生、发展过程，其中以p53基因突变及高表达最为关键。但p53基因突变对ALV-J感染复制的影响及其致瘤作用尚不明确，其作用机制有待进一步研究。该项目拟在对该病肿瘤组织p53基因突变规律研究的基础上，构建突变型和野生型p53蛋白真核表达质粒，转染DF-1细胞，在细胞水平上比较研究两种p53蛋白对ALV-J感染复制、细胞肿瘤相关基因表达、细胞周期及细胞凋亡的影响，并探讨其影响机制；再将突变型和野生型p53蛋白真核表达质粒分别接种胚胎期已感染ALV-J的以及正常的SPF雏鸡，观察接种雏鸡的发病表现，比较研究两种p53蛋白体内过表达对ALV-J感染与致瘤作用的影响以及自身对机体的作用，揭示p53基因突变与ALV-J感染与致瘤的关系，探讨该病发生的分子病理学机制。

p53作为一种抑癌基因，近年来发现p53突变成为大多数肿瘤病发生中的关键致病因素。在前期研究中本课题组发现p53突变及过表达与ALV-J的感染致瘤密切相关，为进一步研究其致病机制，本课题分为两部分：体外实验运用CRISPR-Cas9系统靶向p53基因获得敲除p53的DF-1细胞（p53-KO-DF-1），将ALV-J感染DF-1和p53-KO-DF-1，通过流式细胞术、Western Blot技术、激光共聚焦技术和荧光定量等方法检测p53敲除对ALV-J感染细胞的细胞周期、细胞凋亡和肿瘤相关基因表达影响；为进一步研究p53突变对ALV-J复制及致瘤机制的影响，我们构建了野生型及突变型p53真核表达质粒，转染p53-KO-DF-1，通过qPCR、Western Blot和流式细胞术等方法研究分析肿瘤相关基因、蛋白表达水平及对细胞周期、凋亡、自噬影响；体内实验以SFP鸡为实验对象，通过3胚龄时卵黄囊部位分别注射wtp53及mtp53重组慢病毒构建转基因鸡模型，16胚龄感染ALV-J后于10d、30d、60d、90d定期剖杀，利用GFP荧光信号成像分析、qPCR及Western Blot方法动态监测鸡体内p53过表达状态，利用组织病理学、分子生物学、免疫学和流式细胞术等方法研究突变型p53在体内促进ALV-J复制的具体机制。分析以上结果，本课题工作说明在突变型p53过表达情况下，ALV-J感染DF-1细胞后诱导多种肿瘤相关基因和蛋白上调，引起细胞周期阻滞，抑制细胞凋亡和细胞自噬发生，以此来达到促进病毒复制的效果。当鸡体内p53发生突变，显著抑制免疫器官发育，减弱天然免疫反应，增强感染鸡的泄殖腔排毒情况及病毒血症，促进病毒复制及肿瘤相关基因表达，抑制脾细胞凋亡，这可能是p53突变及过表达发挥致瘤作用的重要机制，为解释肿瘤发生及ALV-J防控提供了新思路。