Hfq蛋白在布鲁氏菌胞内生存中的分子调控机制研究

布鲁氏菌病是由布鲁氏菌引起的一种慢性感染性疾病。鉴于布鲁氏菌没有典型的毒力因子和以超强的胞内生存能力为特点的独特致病机制，本研究以细菌的重要转录后调控子Hfq为切入点，系统分析Hfq突变株毒力表型，分析Hfq在布鲁氏适应胞内恶劣环境及胞内生存中的作用。在此基础上，采用芯片表达谱和比较蛋白质组分析技术，从全基因组水平和蛋白质组水平筛选Hfq调控的靶基因。利用RNA-Seq和免疫共沉淀技术寻找受Hfq直接调控的sRNA和mRNA分子；生物信息学预测Hfq调控sRNA的靶基因，实验验证sRNA与靶基因的结合。选择关键的靶基因，采用lacZ融合报告基因技术和DNA酶I足迹实验技术，深入研究Hfq如何直接调控这些关键基因的转录。最后，汇总以上实验结果，阐述Hfq如何通过在转录后水平调控大量靶基因的表达来调控布鲁氏菌的胞内生存能力，解释布鲁氏菌的胞内生存机制，为开发新的治疗药物和疫苗奠定基础。

布鲁氏菌是一种胞内寄生菌，主要寄生在宿主的巨噬细胞内，胞内生存繁殖是布鲁氏菌致病的关键环节，而适应胞内环境又是布鲁氏菌实现胞内生存的前提。因此，了解布鲁氏菌如何适应胞内的恶劣环境并在其中生存对于理解布鲁氏菌的致病机制至关重要。Hfq蛋白是细菌重要的转录后整体调控子，能同时调控大量靶标基因的表达，进而在包括致病在内的多个细胞过程中发挥整体调控作用。本项目的研究目的是探讨布鲁氏菌Hfq蛋白与布鲁氏菌胞内生存和致病的关系，寻找Hfq调控的靶标mRNA和sRNA，并研究其可能的调控机制。.本项目首先通过同源重组的方法构建了布鲁氏菌的Hfq缺失突变株，并对突变株的胞内生存相关表型进行了分析。Hfq缺失以后，布鲁氏菌的生长速度减慢、达到稳定期的时间延长；在模拟巨噬细胞内环境条件下的生存能力明显下降。进一步的细胞和小鼠毒力实验证实Hfq与布鲁氏菌的胞内生存能力和毒力相关。芯片表达谱和比较蛋白质组分析结果显示，Hfq缺失后，众多基因的转录和表达发生变化，其中很多与布鲁氏菌的胞内生存和毒力相关。进一步的研究显示，Hfq在体内感染过程中也可影响这些毒力相关基因的表达，并最终影响布鲁氏菌的胞内生存能力和毒力。利用RNA-Seq来检测野生株和Hfq突变株中差异表达的sRNA，并进一步利用Northern blot对Hfq相关的sRNA进行了验证。选取了2个与布鲁氏菌胞内生存相关的sRNA，首先明确Hfq蛋白在体内外对sRNA表达的调控作用，利用生物信息学预测sRNA的靶标，并通过双质粒系统实验和凝胶阻滞实验进一步证实了Hfq依赖的sRNA对靶基因的直接调控作用。最后，对Hfq的免疫保护作用进行了评价，发现Hfq突变株对布鲁氏菌的感染具有免疫保护作用。通过研究，我们深入分析了Hfq在布鲁氏菌胞内生存中的作用，解析了Hfq通过在转录后水平调控mRNA和sRNA靶基因的表达来调控布鲁氏菌的胞内生存能力和毒力，明确了Hfq突变株对布鲁氏菌的感染具有免疫保护作用。研究结果为进一步阐明布鲁氏菌的胞内生存机制和致病机理提供新的思路和线索，并为开发新的布病治疗药物和疫苗奠定基础。.通过本项目研究，有1名博士研究生和2名硕士研究生顺利毕业，1名研究人员成长为中青年学术带头人。申请专利1项，发表论文7篇，其中SCI论文4篇。