补肾法诱导KLF4与VEGF形成反馈环路协同调控子宫内膜血管生成的作用机制研究

The transcription factor KLF4 plays an important role in angiogenesis which can improve endometrial receptivity. Previous studies have demonstrated that kidney-tonifying method could up-regulate VEGF expression, facilitate endometrial angiogenesis and improve endometrial receptivity. Our study indicated that KLF4 expression was induced by the kidney-tonifying method and VEGF. Therefore, we speculate that kidney-tonifying method may induce KLF4-VEGF feedback loop formation, subsequently leading to endometrial angiogenesis. The project intends to study whether KLF4 could regulate endometrial angiogenesis and the mechanism by which the kidney-tonifying method induce the KLF4-VEGF feedback loop formation to regulate the endometrial angiogenesis at the cellular level. In addition, we will establish an animal model with decreasing endometrial receptivity by controlled ovarian hyperstimulation. Treated with the kidney-tonifying method, we aim to observe KLF4 expression in endometrial microvasculature by double immunofluorescence staining, and study the effect of KLF4 overexpression or knockdown on expression of VEGF in endometrium which induced by kidney-tonifying method. This study have significant implications for illuminating the theory of “kidney dominating reproduction” and exploring the mechanism of traditional Chinese medicine in improving reproduction.

血管生成是提高子宫内膜容受性的重要环节，转录因子KLF4在血管生成中具有重要作用。前期研究证实补肾法具有上调VEGF、促进子宫内膜血管生成、改善子宫内膜容受性的作用。预实验结果显示，补肾调经方和VEGF在子宫内膜微血管内皮细胞可上调KLF4表达。因此我们推测，补肾法可能诱导KLF4-VEGF形成反馈环路促进子宫内膜血管生成。本项目拟建立细胞模型，用过表达KLF4和特异性敲低KLF4的病毒感染子宫内膜微血管内皮细胞，研究KLF4在子宫内膜血管生成中的作用；探讨补肾法诱导KLF4与VEGF形成反馈环路调控血管生成的机制。在整体水平过表达或敲低KLF4，建立降低子宫内膜容受性的控制性超促排卵小鼠模型并给予补肾干预，采用免疫双荧光染色观察KLF4在子宫内膜微血管中的表达探讨KLF4在补肾法促血管生成中的作用机制。这对于揭示中医“肾主生殖”的理论内涵，探索中医调经种子的作用机制具有重要意义。

辅助生殖技术是治疗不孕症的重要手段，虽然控制性超促排卵方案趋于成熟，但胚胎种植率仍徘徊在20%~30%，着床失败原因主要在于内膜容受不良。因此，改善子宫内膜容受性(ER)成为国内外研究热点。近年研究发现，促进子宫内膜血管生成是改善子宫内膜容受性的关键，是提高IVF-ET妊娠率的有效途径。VEGF是最主要的血管生成调节因子，KLF4是诱导多能干细胞（iPS细胞）的重要诱导因子之一，KLF4和VEGF在血管生成中具有重要作用。本课题组在前期证实补肾法可改善子宫内膜容受性的基础上，根据中医“肾主生殖”的理论，从KLF4在子宫内膜血管生成中的作用，KLF4在补肾法上调VEGF和促进血管生成中的作用等方面出发，建立子宫内膜容受性低下的控制性超促排卵小鼠模型并给予补肾干预，证实补肾法增加微血管密度，促进血管生成，改善子宫内膜形态，从而提高子宫内膜容受性。建立细胞模型，通过过表达KLF4和敲低KLF4的病毒感染细胞，证实VEGF可以促进KLF4表达，KLF4也可以促进VEGF表达，VEGF和KLF4形成反馈环路调控血管生成。同时发现补肾法一方面诱导VEGF和KLF4形成环路，进而增加MMP9，减少Caspase 3表达，促进HEMEC迁移及抗凋亡，进而调控子宫内膜血管生成。另一方面也可提高上调子宫内膜ER的表达，激活ERK信号通路，抑制p65的磷酸化，诱导其出核，进而抑制GRP78的表达，降低内质网应激状态引起的凋亡促进血管生成。这对于揭示中医“肾主生殖”的理论内涵，探索中医调经种子的作用机制具有重要意义。