叶籽银杏EFRO发育过程中基因组DNA甲基化水平、模式及维持机制

以山东省特有的11株叶籽银杏、普通银杏雌株古树、苏铁、铁线蕨为试材，立体、定时、定位观察取样。运用表观基因组学、分子生物学等理论，通过银杏正常胚珠和叶生胚珠不同组织、不同发育期MSAP、HPLC或HPCE分析，及其结果的Southern blotting验证，采用QRT-PCR、SSCP技术、生物信息学结合RT-PCR、Northern blotting等手段进行基因组DNA甲基化分析、序列功能同源性比对、验证DNA甲基化的特异条带，叶籽银杏EFRO具完整ORF的关键基因的获得及基因功能分析。揭示叶籽银杏甲基化分布的时空特异性，探明叶籽银杏EFRO发育与再生过程中甲基化水平和模式、进而了解DNA甲基化的发生变化的位点，剖析DNA甲基化/去甲基化在再生过程中的变化规律。摸清DNA甲基化/去甲基化在EFRO再生过程中的作用，揭示EFRO形成的可能机制及系统学意义。

叶籽银杏作为银杏家族中的一个特异种质，其最大特点在于叶生雌性生殖器官(EFRO)的个体发生和结构。而这种结构的发生产生了许多不能用经典遗传规律解释的可遗传变异,推测这种变异与表观遗传变异有关。目前对此类表观遗传变异的分子机理尚缺乏研究，进一步对叶生雌性生殖器官发生过程的表观遗传变异的深入研究，将有助于理解这类变异的进化意义及其在林木改良中的更有效的利用。. 本研究以我国山东特有的11株叶籽银杏及全国不同产地的22株叶籽银杏及普通银杏雌株古树为试材，以苏铁、铁线蕨作为辅助材料。采用甲基化敏感扩增多态性 (MSAP)分析，扩增获得叶籽银杏、银杏及攀枝花苏铁、铁线蕨四个物种的DNA胞嘧啶甲基化修饰水平及MSAP扩增图谱，其甲基化水平整体较高。MSAP的结果通过Southern blotting或QRT-PCR技术验证。. 通过对叶籽银杏、普通银杏不同发育时期的CCGG/GGCC位点胞嘧啶甲基化的总体分析，发现叶籽银杏、普通银杏在DNA胞嘧啶甲基化模式上存在着丰富的变异，萌动期及展叶期叶籽银杏相对于普通银杏均表现为超甲基化，展叶期的长叶生胚珠的叶籽银杏（YZ）相对于没长叶生胚珠的叶籽银杏（YC）及普通银杏（CK）的超甲基化水平高于萌动期。揭示其叶籽银杏EFRO发育过程中DNA胞嘧啶甲基化具有时空特异性。对叶籽银杏EFRO发育的关键时期的不同组织的DNA胞嘧啶甲基化研究发现，各组织DNA胞嘧啶甲基化水平不同，DNA胞嘧啶甲基化模式存在着广泛的差异。对来自全国不同地区的22株叶籽银杏DNA胞嘧啶甲基化水平及模式变异进行分析，并采用NTSYSpc 软件对不同单株叶籽银杏进行了聚类分析、主成分及DNA胞嘧啶甲基化多样性分析。. 通过对叶籽银杏和普通银杏不同发育时期、不同组织中检测出的差异明显、含量适中的甲基化特异性条带的DNA片段的回收、克隆、测序，检索其同源核苷酸序列，探讨其序列特点及基因功能，解析叶籽银杏叶生拟胚珠发育过程中甲基化差异位点的主要序列片段的基因功能，寻找获得导致叶生拟胚珠形成的关键基因。叶籽银杏在不同时期、不同组织及不同地区这种去甲基化/超甲基化的变化式样及关键基因的研究，对揭示叶籽银杏EFRO形成的可能机制及系统学意义奠定了基础。