水稻白叶枯病菌转录调控因子Clp对III型分泌系统表达的调控作用研究

c-di-GMP是一类细菌中广泛存在的寡核苷酸类小分子物质，作为第二信使、通过与特异性受体的结合和信号传导，调控了细菌的致病性、毒性、环境适应性等。前期研究工作己从水稻白叶枯病菌中鉴定出一个转录调控因子Clp，此基因的缺失导致了细菌致病能力的显著下降。由于Clp具有cNMP结合结构域，推测它可能作为一个c-di-GMP受体，调控III分泌系统(T3SS)和毒性表达。本项目申请(1)用ITC法分析Clp对小分子c-di-GMP的结合作用；(2) 用RT-q-PCR法分析T3SS基因在?clp中的转录情况；(3)用ChIP-Seq法鉴定受Clp直接调控的启动子区域；(4)用EMSA法分析c-di-GMP浓度对Clp结合目标启动子强度的影响。旨在阐明Clp通过接受c-di-GMP信号、直接或间接地调控T3SS表达的分子机理，为解析c-di-GMP信号途径在细菌致病过程中的作用提供实验依据。

本项目旨在明确水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae，Xoo）中的转录调控因子Clp是否为c-di-GMP的受体，并分析受Clp直接调控的基因。具体内容为，首先利用表面等离子共振法（SPR）和等温滴定试验（ITC）检测到了Clp与第二信使c-di-GMP的相互作用，表明Clp蛋白是c-di-GMP的受体。其次利用染色质免疫沉淀并结合二代高通量测序技术（ChIP-seq）的方法，获得了与Clp直接结合的DNA信息。进一步通过生物信息手段分析测序结果，鉴定出78个受到Clp直接调控的peak区域。采用凝胶阻滞（EMSA）对其中的 41个基因启动子进行验证，结果表明大部分荧光标记探针与Clpxoo发生了特异性的结合反应，并且在c-di-GMP参与下不同的基因启动子与Clp的结合能力发生相应的改变。利用qRT-PCR方法，从上述结果中选取18个基因，检测在Δclp中的转录情况。结果发现其中6个基因的表达受到Clp正调控，9个基因的表达受到Clp的负调控，3个基因的表达基本不受Clp的影响。这些结果阐明了Clp是作为c-di-GMP的受体，通过直接调控一系列基因的表达，从而影响细菌的运动性、胞外多糖分泌、及致病性等表型。为今后进一步阐明Clp的作用机制，及Xoo中c-di-GMP的信号调控途径提供了研究基础。