HBV cccDNA形成过程中rcDNA负链冗余序列去除机制研究

HBV cccDNA形成是HBV复制周期中的核心事件之一，cccDNA形成的机制问题是十分重要而又悬而未决的问题。通过分析我们认为，HBV rcDNA是cccDNA的明确前体，rcDNA负链冗余序列去除是rcDNA到cccDNA过程必不可少的环节，阐述rcDNA负链冗余序列去除机制是最终阐明cccDNA形成机制的重要基础。本课题聚焦于rcDNA负链冗余序列去除机制，首先将rcDNA负链冗余序列去除机制具体化为三个主要科学问题，即rcDNA负链冗余序列的去除部位问题，HBV DNA聚合酶是否为该过程必要条件？以及宿主结构特异性核酸酶FEN-1是否与该过程有关? 通过对这些问题的回答，我们将可以大致描述rcDNA负链冗余序列的去除机制，并为最终了解cccDNA形成机制，寻找更有效的抗HBV策略和途径奠定理论基础。

本项目的主要研究目标是探索HBV cccDNA形成过程中rcDNA负链冗余序列的去除机制。为解析该机制，我们至少需要回答三个具体科学问题：1、HBV rcDNA负链冗余序列从哪一端去除？2、POL存在是否为rcDNA负链冗余序列去除的必要条件？3、rcDNA负链冗余序列去除是否与宿主结构特异性核酸酶（FEN-1）有关？围绕这三个问题，我们首先建立了三种新方法，包括：一种基于DNA片段置换技术的可复制HBV1.1倍体的构建方法；一种人工模拟rcDNA分子构建方法；一种HBV cccDNA特异性定量检测方法；以这些方法为基础，结合本项目组构建的特定突变HBV稳定复制细胞系，利用分子和细胞生物学技术，我们对前述三个问题进行了逐一研究，通过对研究结果综合分析，我们可以大致回答前述三个问题： 1、HBV rcDNA负链冗余序列的去除部位主要位于5’端；2、无POL的人工模拟rcDNA分子可在细胞内被修复，提示HBV POL的存在可能并非rcDNA分子5’冗余序列去除的必要条件；3、FEN-1表达抑制并不显著降低HBV cccDNA的形成，提示FEN-1可能并非cccDNA形成过程中的关键分子。通过以上三个问题的回答，我们基本完成了本项目的既定目标，使我们对HBV cccDNA形成过程中负链冗余序列去除机制有了更深入的了解。.本项目的部分研究结果已形成论文发表，其中SCI论著3篇，CSCD论著4篇。通过课题实施，培养了博士生1名，硕士生2名。本项目研究过程中，还意外发现了一些新现象，其中包括一种可以严重影响HBV复制的新突变，我们正在对该突变导致HBV复制严重受损的机制进行研究。另外，本项目的研究结果，为我们提出了后续需要进一步研究的问题，其中很重要的一点是继续寻找参与cccDNA形成的关键分子，本课题所建立的诸多方法为这一问题的研究提供了良好技术平台。