胚胎干细胞衍生的可兴奋细胞Junctophilins功能特征及其GSNO修饰效应

Junctophilins（JPs）是一类新型高度保守膜结合蛋白，作为肌肉，神经等可兴奋细胞连接细胞膜和肌浆网/内质网膜的平台，在细胞内Ca2+自我平衡中发挥关键作用。JPs基因缺失可影响肌肉运动功能，心脏功能，亨廷顿病拟表型2发生，还与胚胎发育及幼仔生存密切相关。外界化学因素对JP-1活性巯基加成，可改变JP-1和RyR1构象，提示存在JPs蛋白翻译后修饰的研究新空间。本项目拟基于已构建的胚胎干细胞定向分化心肌和神经细胞体系，评价不同分化发育时相细胞内[Ca2+]i定位，JPs超微结构表征等，揭示JPs在分化过程细胞内Ca2+自我平衡功能特征和不可或缺的生命现象本质。并通过毒理浓度S-亚硝基谷胱甘肽（GSNO）对JPs巯基的亚硝基化修饰，探索对上述可兴奋细胞功能的影响。阐明药物等外来因素形成毒理浓度GSNO致JPs功能缺陷，与疾病发生，胚胎发育及生命维系，衰老等重要生命过程的可能相关性。

ES细胞体外分化为心肌细胞过程中，Junctophilin2 (JP-2 )表达呈发育依赖性上升，JP-2主要表达在肌钙蛋白Troponin-T和肌小节蛋白β-Actinin阳性区域。siRNA技术干扰ES细胞JP-2基因表达后，中胚层标志，前心肌细胞标志基因表达下调，心肌分化率显著降低，肌小节结构异常；ES细胞衍生化心肌细胞siJp2后，钙瞬变幅度和频率紊乱，对外Ca2+和兰尼碱受体增敏剂咖啡因诱发咖啡因刺激分别呈现“全或无”、无规律钙瞬变，部分心肌肥大标志基因表达上调；siJp2后心肌细胞线粒体膜电位下降，线粒体和内质网结构异常。提示JP-2的心肌经发育依赖性表达“时间窗”起始于分化早期，JP-2表达在心肌和神经元分化成熟，胞内Ca2+平衡和线粒体功能维持起着重要作用。siJp2后，ES细胞衍生心肌细胞和神经元的内质网Ca2+瞬变发生异常，线粒体能量形成中断。电镜显示线粒体和内质网间特定的“并置”结构缺失，并置结构必须的“圈合”元件PGC-1a，Nrf-1和Mfn-2基因下调，提示JP-2在ES细胞衍生心肌细胞维持线粒体和内质网间Ca2+穿梭必要通道“并置”结构和“圈合”元件的不可或缺性。.无论是基因层面还是蛋白层面，JP-3，-4均呈现先上升后下降的表达趋势，其中JP-3的一过性高峰出现在贴壁分化的第5天（d 8+5），而JP-4的高峰则在d 8+0，提示两者脉冲式的表达可能在ES细胞定向分化为神经细胞早期具有特定的生物学意义。JP-3，-4虽在星型胶质细胞中有一定程度的表达，但绝大部分存在于神经元中。在谷氨酸能神经元中表达最多，胆碱能神经元中其次，而GABA能神经元中最少。进一步对分化所得的神经元进行小干扰实验，利用活细胞工作站，动态观测与JP-3，-4密切相关的内质网钙离子释放过程。结果显示si-JP-3，-4后，兰尼碱受体增敏剂咖啡因诱发的钙离子诱导的钙离子释放过程明显受到抑制，而JP-3，-4双干扰后，CICR则被完全阻断，提示ES分化所得神经元中的JP-3，-4均具有其固有的维持胞内钙离子平衡的功能。si-JP-3，-4的神经元分化率及神经标志性蛋白表达量均显著低于阴形序列对照组，且JP-4基因沉默对神经分化的抑制作用强于JP-3，提示JP-3，-4在ES细胞体外分化为神经元过程中起到重要作用。