脂肪酸ω-羟化酶催化特异性研究

ω-Hydroxy fatty acids are important precursors for biodegradable polymer materials. Due to the hydroxyl group in the inactive terminal of the carbon chain, it is difficult to specifically synthesize these compounds using traditional chemical processes. Therefore, microbial transformation of long-chain fatty acids to prepare ω-hydroxy fatty acids has become a research hotspot during the last few years. The enzymes catalyzing the biosynthesis of ω-hydroxy fatty acid are cytochrome P450 monooxygenases, which have been identified from many different microorganisms. These ω-hydroxylases show diverse catalytic activity towards fatty acids of different chain lengths and different saturation levels. However, their catalytic efficiency is not high enough and the product specificity is still very poor. In this study, fatty acid ω-hydroxylases of different origins will be cloned, heterologously expressed and enzymatically analyzed. Special attentions will be paid on the chain-length specificity of the substrates and the hydroxyl group position of the products. Site-directed mutagenesis strategy to modify the active domain of ω-hydroxylase will also be employed to enhance its catalytic activity. Finally, a heterologous system will be constructed to convert fatty acids to their ω-hydroxyl counterparts. This study is expected to lay the foundation for microbial synthesis of ω-hydroxy fatty acids.

ω-羟基脂肪酸是合成生物可降解聚合材料的重要单体，由于其羟基位于不活泼的碳链端，传统的化学工艺很难特异性的合成此类化合物，利用微生物转化长链脂肪酸制备ω-羟基脂肪酸已成为国际上的研究热点。催化ω-羟基脂肪酸生成的酶为细胞色素P450单加氧酶，该酶已经在多种微生物中得到克隆。这些不同来源的脂肪酸ω-羟化酶对不同链长、不同饱和度的脂肪酸具有不同的催化活性，但是普遍存在效率不高、产物特异性不好的问题。本研究拟对不同来源的脂肪酸ω-羟化酶基因进行克隆、异源表达和功能鉴定，并通过生物信息学的手段分析决定其底物链长特异性和产物羟基位置特异性的关键位点，进而采用定点突变的方法改造决定其催化特异性的活性结构域，以期获得改性的脂肪酸ω-羟化酶，并构建异源转化脂肪酸生成ω-羟基脂肪酸的体系。本研究有望为微生物合成ω-羟基脂肪酸打下基础。

ω-羟基脂肪酸是合成高性能聚合材料的重要单体，其羟基位于不活泼的碳链端，传统化学工艺很难特异性的合成此类化合物，利用微生物转化脂肪酸制备ω-羟基脂肪酸是一条有效的潜在生产方法。生物体中催化ω-羟基脂肪酸合成的关键酶是脂肪酸ω-羟化酶，该酶属于细胞色素P450单加氧酶家族。本研究工作克隆了三种不同来源的脂肪酸ω-羟化酶（巨大芽孢杆菌的CYP102A1、枯草芽孢杆菌的CYP102A3和短小芽孢杆菌的CYP102A15），并连接到原核表达载体上，在大肠杆菌中进行了异源表达和纯化，各个酶在大肠杆菌中均获得相应的条带；为了鉴定这些脂肪酸ω-羟化酶的羟化产物并测定其含量，我们建立了用于羟基脂肪酸定量分析的气相色谱-质谱联用方法，实现了对不同链长、不同位置ω-羟基脂肪酸的表征；在此基础上，采用全细胞催化转化脂肪酸的方法测定了CYP102A15和CYP102A3底物链长特异性和产物羟基位置特异性，结果表明CYP102A15和CYP102A3均对C12、C14脂肪酸显示出较高的活性，其催化产物中，CYP102A15以ω-1-羟基脂肪酸为主，而CYP102A3的ω-3-羟基脂肪酸比例较高。进一步参照巨大芽孢杆菌的CYP102A1，对短小芽孢杆菌的CYP102A15进行了定点突变研究，发现了G73和F88位点对于其催化活性和产物羟基位置特异性具有重要作用。以C14脂肪酸作为底物，G73S突变子丧失了对ω-1的选择性，其产物为ω-1-C14，ω-2-C14和ω-3-C14三种产物的混合物，且比例相差不大；而G73A突变子的羟基脂肪酸组成仍以ω-1-C14为主。F88G和F88A突变对于羟基位置的影响最大，转化产物中不仅检测到ω-1-C14，ω-2-C14和ω-3-C14羟基脂肪酸，还进一步发现了ω-4-C14和ω-5-C14羟基脂肪酸。在此基础上，我们进一步构建了转化长链脂肪酸生成ω-羟基脂肪酸的工程菌株和直接以葡萄糖为原料合成ω-羟基脂肪酸的工程菌株。其中，转化长链脂肪酸在特定位置羟化生成ω-羟基脂肪酸的工程菌株在摇瓶水平ω-羟基脂肪酸的产量可达60.5mg/L，而以葡萄糖为原料合成ω-羟基脂肪酸的工程菌株在发酵罐的产量可达568mg/L。以上研究加深了对脂肪酸ω-羟化酶的认识，为采用生物催化转化技术制备ω-羟基脂肪酸奠定了基础。相关成果发表SCI论文论文5篇，申请发明专利2件。