基于噬菌体展示技术的士的宁靶点蛋白筛选研究

本项目旨在筛选马钱子活性成分和毒性成分士的宁作用的靶点蛋白，为深入研究士的宁作用机制和毒理机制奠定基础。项目采用噬菌体展示技术，以经过纯化和生物学活性检查的生物素化士的宁为靶分子，随机七肽、十二肽噬菌体文库为筛选文库，经3-5轮吸附-洗脱-扩增的生物淘洗过程，获得与靶分子具有高度特异性和高亲和力的噬菌体，测定插入的外源DNA序列，得到一系列潜在的Stry靶点蛋白。对筛选得到的靶点蛋白序列进行生物信息学分析发现其共有序列的核心序列，即为士的宁靶点蛋白，分析其可能的作用机制，并进行该蛋白的固相合成，以验证其生物学功能。

本项目根据项目计划书及实际研究需要，主要进行了如下研究：.1. 建立了士的宁分析方法：分别采用HPLC和质谱分析，建立了士的宁及生物素化士的宁的分析鉴定方法； .2. 构建了具有自主知识产权的适用于多种中药分子靶点蛋白筛选的噬菌体展示随机十五肽库：本部分为项目实施过程中添加内容，在构建中以pCANTAB 5E噬菌粒为载体，通过自行设计引物与模板，采用PCR技术进行模板扩增获得编码随机十五肽的基因。将扩增后的目的基因经过双酶切后，电转入大肠杆菌TG1感受态细胞，集合菌落后进行库容和多样性检验，所建肽库库容可达5×108。随机挑取20个克隆测序，其核苷酸序列及推断出的氨基酸序列均随机，结果成功构建了库容量与多样性都满足筛选要求的噬菌体随机十五肽库；.3. 士的宁、天花粉蛋白的靶点蛋白进行筛选：除项目申报时的研究对象小分子成分士的宁外，还另外研究了大分子中药活性成分天花粉蛋白，以考察噬菌体展示技术在不同结构特征的中药成分靶点蛋白筛选中的可行性。采用自行构建的随机十五肽库和商品化肽库和分别对两种不同结构特征和活性功能的中药分子士的宁和天花粉蛋白进行靶点筛选研究，获得噬菌体展示技术研究不同种类中药分子作用机制的初探数据；.4. 士的宁及其同系物与甘氨酸受体结合的生物信息学分析：本部分为项目实施过程中添加内容。通过对士的宁体内常见的受体甘氨酸受体的同源模建、分子动力学模拟和分子对接研究，获得士的宁与甘氨酸受体作用的计算机高度可靠模型和大量信息，并与实验获得的功能研究数据进行比对和相关性研究，为中药小分子作用机制的研究提供了新的思路和方法。.本项目在执行期内，完成了项目申报时的预期目标，发表了7篇论文，申请了专利1项，另有1篇SCI论文已接收，3篇SCI论文在写作之中，培养了一名硕士研究生。.本项目严格按照国家自然科学基金经费支出的规定和要求，根据研究需要合理支出经费。