MG132通过上调Nrf2/ARE信号通路治疗糖尿病肾病的实验研究

Treatment of diabetic nephropathy (DN) has been the focus of clinical research；however，there is no effective approach available so far. Therefore, it is an urgent need to explore a new way to treat DN. Oxidative stress can cause renal tissue damage because reactive oxygen species (ROS) can disrupt the balance between antioxidants and ROS generation. As one of the most critical endogenous anti-oxidative mechanisms, NF-E2-related factor 2 (Nrf2) has potent antioxidative activity to prevent ROS-induced damage. In addition, accumulating evidence demonstrates that MG132, an inhibitor of proteasome, can upregulate the expression of Nrf2 indirectly via protecting Nrf2 from degenerating by proteasome. Therefore, we hypothesize that MG132 may have the therapeutical effect on DN trough activating Nrf2/ARE pathway to increase antioxidative compounents that scavenge ROS accumulation and consequent oxiative damage. In our project we will use OVE26 mice to set up DN model. This model can mimic the pathogenic progress of human DN very well. To our knowledge, this is the first time to use MG132 to treat DN mice with obvious proteinuria. The efficacy will be evaluated by detecting renal damage markers. Then we will explore the mechanism by using Nrf2 activator and Nrf2-siRNA to upregulate and downregulate Nrf2 expression in human renal mesangial cells, respectively, and detecting the change of Nrf2/ARE pathway. Finally, we plan to use Nrf2 gene knockout mice to further confirm the central role of Nrf2/ARE pathway in treatment of DN using MG132. The completion of this project will provide a new method for the treatment of DN and will bring important theoretical sense and social value.

目前糖尿病肾病（DN）的治疗尚缺乏有效手段，因此探索治疗DN的新方法势在必行。氧化应激可通过产生过量的活性氧簇（ROS）导致肾组织损伤，而内源性抗氧化剂转录因子NE-F2相关因子2（Nrf2）可以减少ROS产生，具有潜在的抗氧化活性。证据表明，蛋白酶体抑制剂MG132可以通过抑制Nrf2的降解而上调其表达。因此，我们推测MG132可能通过上调Nrf2/ARE信号通路，提高机体抗氧化能力，从而治疗DN。本项目拟采用OVE26小鼠建立更接近人的DN模型，并首次应用小剂量MG132治疗已出现显性蛋白尿的DN小鼠，通过观察肾脏损伤指标的变化评价其治疗效果；然后分别上调和下调人肾小球系膜细胞的Nrf2表达，在细胞水平探讨可能机制；最后通过体内敲除Nrf2基因，验证Nrf2/ARE信号通路在MG132治疗DN中的核心作用。本课题的完成将为DN的治疗开辟新途径，具有重要的理论意义和社会价值。

糖尿病肾病（DN）是导致终末期肾衰竭的最重要原因。然而，目前针对DN的有效治疗手段并不令人满意，因此探索治疗DN的新方法势在必行。氧化应激可通过产生过量的活性氧簇（ROS）导致肾组织损伤，而内源性抗氧化剂转录因子NE-F2相关因子2（Nrf2）可以减少ROS产生，具有潜在的抗氧化活性。证据表明，蛋白酶体抑制剂MG132可以通过抑制Nrf2的降解而上调其表达。因此，我们推测MG132可能通过上调Nrf2/ARE信号通路，提高机体抗氧化能力，从而治疗DN。为探讨蛋白酶体抑制剂MG132对DN的治疗作用，我们在本项目的实验一中给予3月龄转基因1型糖尿病（OVE26）小鼠腹腔注射MG132 (10 μg/kg/day)，此时OVE26小鼠已表现为肾功能异常（尿蛋白增加）。MG132治疗3个月后，处死小鼠，收集相应标本。结果显示，与同龄未治疗的糖尿病小鼠相比，经MG132治疗的糖尿病小鼠肾脏病理和功能均明显改善。MG132的治疗作用伴随着肾脏Nrf2蛋白表达增加以及Nrf2下游抗氧化基因转录水平上调。我们在实验二中体外培养人肾小管上皮细胞 (HK11)，通过给予高糖/高脂和MG132等处理模拟体内试验，并应用Nrf2特异性siRNA沉默HK11细胞的Nrf2基因，从而探讨Nrf2在MG132防治DN过程中的核心作用。结果表明，经Nrf2特异性siRNA预处理，MG132对高糖/高脂导致的Nrf2及其下游抗氧化基因的上调作用均明显减弱，并且高糖/高脂诱导的HK11细胞高结缔组织生长因子表达被完全逆转。为进一步在体内验证Nrf2在MG132治疗糖尿病肾病中的核心地位，我们选用Nrf2基因敲除小鼠为研究对象，按实验一方案进行实验三。结果显示，与野生型糖尿病小鼠相比，Nrf2基因敲除的糖尿病小鼠尿蛋白增加更明显、肾脏病理改变更严重，伴随着肾脏氧化应激、炎症和纤维化程度的进一步升高；给予MG132干预后肾脏氧化损伤程度虽无明显减轻，但肾脏的炎症和纤维化程度明显减轻，并伴随IκB-α的升高和NF-κB的降低，提示MG132另外的肾脏保护机制可能与MG132阻断IκB-α在蛋白酶体中降解，间接降低了NF-κB的蛋白水平有关，从而在没有Nrf2存在的情况下仍然能够发挥肾脏保护作用。本课题的完成将为DN的治疗开辟新途径，具有重要的理论意义和社会价值。