小檗碱通过MAPK信号通路上调neuritin治疗糖尿病中枢神经病变

前期发现：小檗碱延缓糖尿病中枢神经病变大鼠海马超微病理结构的改变，具有保护中枢神经元作用。神经营养因子neuritin在神经再生和可塑性中扮演着重要角色，通过激活MAPK信号通路上调其表达；小檗碱抗糖尿病作用与MAPK信号通路密切有关。推测：通过MAPK信号通路上调neuritin表达可能在小檗碱治疗糖尿病中枢神经病变中起着重要作用。拟采用已建立由注射小剂量链尿菌素加高糖高脂饲料喂养的糖尿病中枢神经病变大鼠模型，观察小檗碱对糖尿病大鼠躯体感觉诱发电位、神经传导速度、行为学、海马超微病理结构、neuritin表达和MAPK各亚族信号通路等的影响；原代培养糖尿病中枢神经病变大鼠和胎鼠海马神经元，通过阻断和激活MAPK各亚族信号通路及neuritin，观察神经元存活、neuritin表达、MAPK信号通路及小檗碱的干预作用。以期对小檗碱调控neuritin表达治疗糖尿病中枢神经病变提供实验依据。

已完成本项目的内容，发表SCI论文5篇，中文5篇，培养研究生2名，授权1项国家发明专利，获1项重庆市科技进步二等奖。用高糖高脂饲料喂养加腹腔注射小剂量链脲菌素（35 mg/kg）建立糖尿病中枢神经病变大鼠，观察经小檗碱治疗后，糖尿病大鼠在血糖血脂、躯体感觉诱发电位、神经传导速度和海马超微病理结构的变化，分析小檗碱治疗对糖尿病大鼠血糖、血脂及神经病变的影响。小檗碱治疗24周后降低糖尿病大鼠血糖、糖化血红蛋白和血脂水平，并改善躯体感觉诱发电位和提高神经传导速度，也改善海马超微病理结构，提示小檗碱对成功建立的糖尿病中枢神经病变大鼠具有治疗作用。采用real time PCR和western blotting检测发现，糖尿病大鼠海马中neuritin表达明显降低，小檗碱可上调neuritin表达；糖尿病大鼠海马中ERK1/2、JNK、p38 MAPK mRNA及p-ERK1/2、p-JNK1/2、p-p38 MAPK蛋白表达均显著增加，小檗碱下调了海马中升高了的JNK、p38 MAPK mRNA及p-JNK1/2、p-p38 MAPK蛋白表达水平，但不影响ERK1/2的表达。提示，小檗碱治疗糖尿病中枢神经病变作用与上调海马neuritin表达密切有关。采用胰酶消化法结合无血清培养基培养新生大鼠的原代海马神经细胞，经神经细胞特异性烯醇化酶鉴定细胞为阳性。神经细胞接种6～8 d后，平均纯度为（92.6 ± 4.62）%，达到实验要求。还采用神经生长因子诱导，使PC12细胞分化为神经细胞，符合神经细胞细胞的形态特征。采用慢病毒载体高表达和RNA干扰技术，分别高表达和阻断神经细胞neuritin表达，MTT法检测吸光度值和图像分析软件ImageJ分析神经细胞轴突长度，观察neuritin神经细胞活性的影响。结果发现，上调neuritin表达可增强神经细胞的存活和增加神经轴突的长度；阻断neuritin表达则抑制神经细胞的活性和减少轴突的长度。使用拮抗剂和激动剂分别阻断、激活MAPK各亚族信号通路，采用real-time PCR、western blotting检测neuritin表达。结果发现，阻断p38、JNK信号通路均抑制neuritin表达，激活p38、JNK信号通路则上调neuritin表达，但ERK信号通路不影响neuritin表达。