银杏小孢子母细胞受秋水仙碱加倍诱导状态下的特异性应激基因表达调控机制

Polyploidization is an important force in promoting the evolution of plants. However, woody gymnosperms have a lower polyploidy compared with other xylophyta. Ginkgo biloba L. is dioecious gymnosperms. As a special species in the evolutionary history of plants, the chromosome polyploidization of G. biloba has been a problem to be resolved in evolutionary biology of plants and genetic breeding. Through early study, we have found that the variation of G. biloba’s microsporocyte protein expression has a close relationship with the extremely low probability of acquiring colchicine induced 2n male gamete. So based on the research, we propose an assumption that some regulatory mechanism of specific gene expression in response to the stress of colchicine exist in G. biloba’s microsporocyte and influence the success of acquiring 2n male gamete. To confirm this hypothesis, Association analysis of the proteome and transcriptome were adopted, using RNA-Seq and Label-free to analysis the expressional differences of key genes between the G. biloba’s microsporocyte and Populus microsporocyte in the process of colchicine-induce, hoping to revealing the regulatory mechanism of G. biloba’s microsporocyte specific gene expression in the process of colchicine stress from the viewpoint of molecular biology. Our research results will lay a foundation for the ploidy breeding and molecular breeding of G. biloba in the future.

多倍化是促进植物发生进化改变的重要力量。但在木本植物中，裸子植物的多倍性相对较少。银杏是雌雄异株的裸子植物，作为在植物进化史上具有特殊地位的物种，它的染色体多倍化一直是植物进化生物学和遗传育种学的亟解难题。本课题组经前期研究发现，银杏小孢子母细胞蛋白表达变化与秋水仙碱诱导银杏2n雄配子得率极低有着密切关系，并在此基础上提出了“银杏小孢子母细胞内存在影响秋水仙碱诱导银杏2n雄配子得率的特异性应激基因表达调控机制”的研究假设。为了验证这一假设，本项目采用蛋白质组和转录组关联分析方法，利用RNA-Seq和Label-free技术，以银杏小孢子母细胞和杨树花粉母细胞为对照研究对象，对比分析两者在秋水仙碱加倍诱导过程中基因表达调控方面的差异。从分子生物学角度，揭示这一过程中银杏小孢子母细胞的特异性应激基因表达调控机制。研究结果将为今后银杏倍性育种和分子育种的开展奠定基础。

为了探究在银杏小孢子母细胞内是否存在影响秋水仙碱诱导银杏2n雄配子得率的特异性应激基因表达调控机制，本项目开展了如下研究工作：利用免疫荧光染色技术和生理生化检测技术，从细胞微管骨架结构和生理生化指标变化角度，分析了经秋水仙碱诱导处理的银杏小孢子母细胞在0-96h中各主要时间节点的差异情况；2）利用包括RNA-Seq、iTRAQ标记和GC-MS在内的检测技术，从基因、蛋白质和代谢物的变化角度，获得了秋水仙碱处理组与蒸馏水对照组相对应的差异表达基因、差异表达蛋白和差异代谢物；3）采用多组学关联分析方法，探究了在秋水仙碱加倍诱导状态下银杏小孢子母细胞基因表达、蛋白表达以及代谢物合成之间的相应性关系。.主要结果如下：（1）筛选确定了银杏小孢子母细胞受秋水仙碱加倍诱导过程中在0-96h范围内的发育高差异时间为48h；（2）绘制并注明了银杏小孢子母细胞受秋水仙碱加倍诱导过程中，包括高差异表达基因、高差异表达蛋白和高差异代谢物变化情况在内的银杏小孢子母细胞相关信号通路图；（3）初步确定了包括代谢途径、次生代谢产物生物合成、ABC转运蛋白、嘌呤代谢和嘧啶代谢在内的5个有显著性变化的KEGG通路；（4）发现了在整个表达调控过程中有1427个基因发生了差异表达，18种蛋白质或酶参与其中并发生了显著性改变，同时还有5类代谢物于这一过程中被大量合成或转变；（5）绘制了3个包括差异表达基因和差异表达蛋白、差异表达基因和差异代谢物、差异表达蛋白和差异代谢物的对应相关性网络图。.以上工作从植物分子生物学角度，初步揭示秋水仙碱加倍诱导过程中银杏小孢子母细胞的特异性应激基因表达调控变化情况，研究结果将为今后银杏倍性育种和分子育种的开展奠定基础。