基于化学遗传学的金属抗肿瘤药物分子作用机理研究新方法

Cisplatin and the second/third generation of platinum-based anticancer drugs have been widely used for treatment of solid tumours over the past decades. A large number of studies have demonstrated that cytotoxic platinum-based drugs directly attack and damage DNA, which inhibit DNA replication and transcription to induce apoptosis or necrosis. However, so far few reports have been seen to elucidate the genome-wide distribution of the platinum-damaged DNA sites and to investigate the changes in the protein (gene product) expression profiling caused by the DNA lesions directly or inderectly. The proposed project aims to construct protein/peptide-based affinity probes, which can specifically recognize platinum-damaged DNA sequences, to separated and enrich damaged DNA fragments from various cancer cells including drug-sensitive and resistant cells. These isolated damaged DNA fragments will subsequently be sequenced by update and high throughout sequencing techniques so as to elucidate the distribution of the platinum-damaged DNA sites in genome-wide. Meanwhile, we will develop mass spectrometry-based proteomic methods to quantify differential protein expressions caused by the DNA lesions, and investigate the molecular mechanism of action of platinum-based anticancer agents at the whole-genome and proteome levels. The research outcome of the proposed project will provide not only novel insights into the better understanding on the mechanism of action of anticancer metallodrugs and novel potential drug targets for treatment of cancers, but also novel chemical genetics-based strategies for molecular pharmacologic studies of other types of anticancer drugs.

以顺铂为代表的金属抗癌药物是临床上广泛使用的一线化疗药物。细胞毒性的铂基抗癌药物通过攻击、损伤DNA，抑制DNA的复制和转录，进而诱导细胞凋亡或坏死。但是到目前为止，基因组水平上铂类药物损伤位点的分布及其直接或间接导致的蛋白质（基因产物）表达水平的变化少有文献报道。本项目旨在构建能特异性识别铂基(候选）药物损伤DNA片段的蛋白质/多肽亲和探针，分离富集不同肿瘤细胞（包括敏感细胞和耐药细胞）中药物损伤基因片段，应用高通量测序技术检测DNA损伤在基因组水平上的分布。与此同时，发展和建立基于质谱的蛋白质组学分析方法，研究铂基药物通过基因损伤导致的蛋白质差异表达谱，从基因组和蛋白质组水平上阐释铂基抗癌药物的分子作用机理。本项目研究不仅有助于进一步理解铂基抗肿瘤药物的作用机制，发现新的抗肿瘤药物作用靶标，还能为其它类型抗肿瘤药物的分子药理学研究提新方法和新技术。

以顺铂为代表的金属抗癌药物是临床上广泛使用的一线化疗药物。细胞毒性的铂基抗癌药物通过攻击、损伤DNA，抑制DNA的复制和转录，进而诱导细胞凋亡或坏死。但是，迄今为止，基因组水平上铂类药物损伤位点的分布及其直接或间接导致的蛋白质（基因产物）表达水平的变化少有文献报道。本项目致力于发展和建立正向/反向化学遗传学研究方法，鉴定顺铂损伤DNA在基因组水平上的分布,进一步研究铂基药物通过基因损伤导致的蛋白质差异表达谱，从基因组和蛋白质组水平上阐释铂基抗癌药物的分子作用机理。主要研究成果包括：① 构建了一种HMGB1a蛋白亲和探针，从顺铂处理的肿瘤细胞中捕获、分离顺铂损伤DNA片段，进而通过高通量测序技术鉴定出13471个顺铂损伤基因。生物信息学分析表明，这些损伤基因主要涉及精子活力和蛋白质磷酸化两个信号转导通路，其中SPAG9基因在单倍体睾丸细胞中高表达。这一结果从基因水平上解释了顺铂对睾丸癌治愈率高的原因；②发展了定性定量蛋白质组学分析方法，研究铂基药物通过基因损伤导致的蛋白质差异表达谱，结果表明顺铂的基因损伤导致蛋白质磷酸化相关蛋白质的差异表达，从蛋白质组水平上阐释了顺铂抗癌作用的分子机理；③发展和建立了一种功能化磁性纳米亲和探针和质谱分析相结合的顺铂损伤DNA应答蛋白质组学分析方法，捕获和鉴定了顺铂敏感细胞和耐药细胞对顺铂损伤DNA的差异应答蛋白质组。结果表明，顺铂诱导核酸修复相关蛋白质和细胞凋亡相关蛋白质的差异表达，是肿瘤细胞产生获得性耐药性的主要原因。项目执行期间，发表SCI论文22篇，国际、国内会议论文14篇，申请中国发明专利1项，培养博士研究生3名，硕士研究生2名，博士后1名，圆满完成了项目研究计划。