核糖体蛋白RPL23通过Miz1/c-Myc分子途径参与骨髓增生异常综合征发病的机制研究

Ribosomal proteins (RP) L23 carries out a range of extraribosomal functions, such as regulating cellular proliferation, differentiation and apoptosis, besides being involved in the progress of protein biosynthesis. The role of RPL23 in the pathogenesis of myelodysplastic syndromes (MDS) still remains unknown. Our previous studies have showed that MDS patients with RPL23 over-expressed presented apoptosis-resistance of hematopoietic cells in bone marrow, higher tranformation to acute myeloid leukemia and shorter survival time. The mechanism underling the phenomenon is still not well understood. C-Myc has been proved to play an important role in the process of cellular apoptosis. Miz1, Myc-associated zinc-finger protein can inhibit the transcription activity of c-Myc. A recent study reported that RPL23 is a negative regulator of Miz1-dependent transactivation. Our hypothesis is that RPL23 may have an essential function in restricting Miz1-dependent apoptosis and controling the ability of Myc to inhibit cell apoptosis. To prove the hypothesis, methods such as transfection with lentivirus, RNA interferon, in vitro colony formation cultivation, flow cytometry, real time PCR, immunoprecipitation and western blot will be used on MDS cell line(MDS-L) and normal CD34(+) hematopoietic stem cells to identify the role of Miz1/c-Myc pathway in the apoptosis-resistance of MDS cells mediated by RPL23. This study will provide a new insight into the pathopysiology of MDS and a clue to search for new therpy for MDS.

核糖体蛋白(RP)L23除参与蛋白质生物合成外，还调节细胞增殖、发育、凋亡等过程。迄今对RPL23在MDS发病中的作用及机制还知之甚少。我们的前期研究显示RPL23高表达的MDS造血细胞凋亡抵抗、白血病转化率高，其机制有待进一步探讨。C-Myc具有抑制细胞凋亡作用，Miz1是c-Myc关联锌指蛋白，抑制c-Myc转录活性。研究显示RPL23负性调控Miz1活性。为此，我们提出假说：RPL23可能通过负性调节Miz1，激活c-Myc，抑制MDS细胞凋亡。为了验证这一假说，我们将通过人MDS细胞系MDS-L和正常人CD34(＋)细胞；采用慢病毒载体转染、基因导入、RNA干扰、免疫沉淀、WB等手段，探讨RPL23在MDS细胞凋亡异常中作用，明确RPL23通过Miz1/c-Myc分子途径对MDS细胞凋亡的调控机制。本研究将从RPL23这个新视点揭示MDS凋亡抵抗发生机制，为MDS治疗提供新的思路。

核糖体蛋白是组成核糖体的主要成分，还具有核糖体外功能。骨髓增生异常综合征是一组起源于骨髓造血干/祖细胞的恶性克隆性疾病，以骨髓造血细胞发育异常，并进而导致骨髓衰竭或高风险向白血病转化为特征。应用全基因组芯片对不同分型MDS 患者骨髓CD34(+)细胞基因表达谱进行扫描，发现核糖体蛋白RPL23在进展型MDS患者中表达明显增高。为进一步研究核糖体蛋白RPL23 在MDS 发病中作用机制，本课题进行了以下三部分研究： 第一部分验证RPL23 表达水平与骨髓造血细胞凋亡的关系，采用流式细胞术检测MDS骨髓CD34（＋）细胞的凋亡情况，结果显示RPL23 表达水平与MDS 患者骨髓CD34（＋）细胞凋亡率呈现负相关；第二部分研究RPL23与MDS造血细胞凋亡抵抗的机制，以慢病毒作为载体，通过siRNA 敲低正常人CD34(＋)造血干细胞RPL23 表达，利用RT－PCR、Western Blot、免疫沉淀鉴定其对Miz1、c-Myc 及其下游分子p21、p15 的调节；第三部分研究外源性敲低SKM-1细胞系RPL23的表达，细胞功能学变化以及相关机制，结果显示敲低RPL23的SKM-1细胞呈现增殖受抑、凋亡增加、周期阻滞。基因谱表达芯片分析显示：593个基因表达上调，772个基因表达下调，差异均有统计学意义。我们根据芯片分析结果筛选出两条通路，即RPL23/Miz-1/MYC/P15/P21通路和PI3K/AKT通路。通过RT－PCR、Western Blot等技术研究下游通路机制。同时我们还研究了SKM-1 细胞在不同的RPL23 表达水平下，对高三尖杉酯碱、阿糖胞苷、地西他滨等药物反应。