小麦淀粉废水发酵生产丁醇及丙丁菌高浓度溶剂耐受机制的研究

丁醇是一种重要的平台化合物，也是一种极具潜力的生物能源，作为燃料其性能比乙醇更为优越。发酵原料成本和丁醇的毒性是造成丁醇发酵生产成本较高和丁醇产率较低的关键因素。本项目在已获得的能利用小麦淀粉废水发酵产丁醇18-19g/L、总溶剂30-33g/L的高耐受、高产丁醇丙丁菌BH-9基础上，模拟自然进化过程继续驯化选育高浓度丁醇耐受菌。采用差异蛋白质组学技术和代谢通量分析方法研究比较丁醇高耐受突变株与丁醇低耐受原始菌；优化条件下高浓度溶剂发酵与常规发酵的蛋白表达差异和代谢流量分布变化；揭示菌株高浓度溶剂耐受机制及丁醇合成反应的关键性限制步骤，进一步指导该菌株的基因遗传改造和培养条件优化。本课题的实施对生物化工产业循环经济模式的发展和国民经济可持续发展都具有重要的理论意义和实用价值。

丁醇是一种重要的平台化合物，也是一种极具潜力的生物能源，发酵原料成本过高和丁醇的毒性导致丁醇的产率较低是丙丁发酵的瓶颈和亟待解决的关键问题。.通过本项目的研究获得了丰富的丙丁菌种资源，采用创新高效筛选方法，获得了高丁醇耐受性、高产量菌株；获得了多种非粮原料发酵生产丁醇的菌种和工艺，通过优化工艺丁醇产量显著提高；多角度多层次阐明丁醇耐受菌的耐受新机制。具体研究成果如下：.1、采用人工生物模拟进化ASBE和多指标可视化平板，快速选育高耐受性、高产丁醇菌株。.通过自行设计的“三明治”筛选方法，从土样中筛了200多株丁醇产生菌，其中产量较高有3株，经16S rDNA鉴定为C.beijerinckii G23、C. acetobutylicum D64、C. acetobutylicumPW12。通过N+束注入诱变、NTG和紫外线诱变及人工模拟生物进化（ASBE）等育种手段，并结合多指标可视化筛选方法共获得高耐受性、高产菌YT-37、MUT3、SE25、NT641、NT642、NT643、NT644、NT645，其中NT642可耐受3 % （v/v）丁醇，发酵7 %玉米醪，丁醇及总溶剂产量分别为15.4 g/L和22.4 g/L。.2、发酵工艺优化研究。.以小麦废水、木薯、糖蜜以及玉米芯水解液为发酵原料，菌株G23只能利用玉米芯水解液为发酵原料，而PW12对四种原料均可很好的利用；在小麦淀粉废水（淀粉3.24%）添加木薯粉5 %、蛋白A 3 %、丁酸钠0.1 %、K2HPO4 0.1 %条件下。丁醇平均产量19.32g/L，总溶剂产量达32.34g/L。.3、丁醇产生菌溶剂耐受机制研究。.（1）高溶剂耐受菌可通过减小细胞表面积和形成生物膜来抵抗丁醇的冲击；.（2）高溶剂耐受菌通过适当降低细胞其表面疏水性时，来提高细胞抵抗有机溶剂的能力；.（3）在2.5 %丁醇环境下，高溶剂耐受菌SE25的膜电位仅下降9.8 %，膜通透性仅增加11.3 %，原始菌PW12膜通透性增加72 .1 %，膜电位下降80.2 %，说明在高浓度丁醇胁迫条件下，高溶剂耐受菌SE25细胞膜能保先较好的完整性。.（4）耐受菌SE25细胞膜中饱和脂肪酸所占总脂肪酸的比例较原始菌 PW12 提高了 22.13 %，细胞膜不易流动，通过提高细胞膜的刚性抗击溶剂。