p53-MDM2界面环肽抑制剂的设计、合成、生物活性和作用机制研究

For the past few years, it is showed that tumor suppressor p53 can effectively inhibit the growth of tumor. MDM2, an oncogene may negatively regulates p53 function through binding to and forming a complex with p53. So it is important to find an inhibitor of the p53-MDM2 interaction. A series of cyclopeptides will be designed according to computer-aided method and successfully synthetized via solid phase synthesis technology and an optimized and versatile synthetic route. Expression and purification of MDMX2（1-118） will be carried out and a fluorescence polarization assay is used to determine dissociation constants for peptide–protein interaction. Cell viability is assessed by addition of 3-(4,5-dimethylth-iazol-2-yl) -2,5-diphenyl-tetrazolium bromide (MTT). Western-Blot analysis is carried out to identify mechanisms. The cyclopeptide with highest activity will be cocrystallized with recombinant MDM2 to confirm the mechanism of p53-MDM2. Compared with liner peptides and stapled peptides, cyclopeptide inhibitors of the p53-MDM2 interaction will be explored, and cyclopeptide with high activity can serve as leading compounds for antitumor drugs.

近年来，研究表明抑瘤蛋白p53能有效的抑制肿瘤的生长，而癌基因蛋白MDM2能直接与p53相互作用，从而阻止p53发挥正常功能。因此，寻找抑制P53-MDM2相互作用的分子已成为开发新型抗肿瘤药物的重要方向之一。本研究拟利用计算机辅助药物设计的方法设计一系列能够与MDM2特异性结合的环肽类化合物；随后采用固相多肽合成的方法合成目标分子；并对这些分子开展MDM2蛋白（1-118）的表达与纯化以及荧光偏振结合试验、MTT抗细胞增殖试验、Western-Blot试验。最后，将选择活性最好的环肽分子与重组的MDM2进行共结晶，进一步确认目标环肽和MDM2的作用模式。本研究将探寻除直链肽及Staple修饰多肽之外的第三类多肽分子作为p53-MDM2相互作用的抑制剂，获得的活性环肽可为抗肿瘤药物的研究提供先导分子，因此，本项目具有重要的理论意义和良好的应用前景。

近年来，研究表明抑瘤蛋白p53能有效的抑制肿瘤的生长，而癌基因蛋白MDM2能直接与p53相互作用，从而阻止p53发挥正常功能。前期刘实验室发现了一系列MDM2/MDMX的D肽拮抗剂，包括DPMI-α, DPMI-β和DPMI-γ, 在脂质体技术的帮助下，这些多肽在体外和体内均表现出了一定的抗肿瘤效果。但是全D肽在体内不能完全被降解，对MDMX的结合能力普遍不强。因此，在本项目中我们在充分分析PMI-MDM2/MDMX复合物结构的基础上将PMI的Ser-11进行D氨基酸的突变，通过固相多肽合成法得到了一系列包含D型氨基酸的杂交肽。.首先，我们利用表面等离子共振技术测定了Kd值；然后，我们将这些杂交肽包裹在脂质体中，评价其对肿瘤细胞U87的抑制作用，发现目标多肽liposome-PMI-1对肿瘤细胞U87的抑制能力明显优于阳性对照Nutlin-3；随后，我们利用一种特异性的蛋白酶cathepsin G对目标多肽进行稳定性考察；下一步，我们又对目标化合物进行圆二色波谱分析，证实引入D-氨基酸并没有引起多肽α-螺旋的明显变化；再下一步，我们又将目标多肽与靶蛋白进行对接；最后，我们通过流式细胞技术测定目标多肽诱导的细胞死亡模式，表明liposome-PMI-1通过细胞凋亡的机理来抑制肿瘤细胞的增殖。本项目中我们开发了一种新型的D氨基酸突变策略，为多肽的成药提供了一个新的思路。.在该项目经费支持下已经发表SCI论文10篇；研究成果申请中国发明专利1项；培养博士研究生1名；参加国内学术会议3次。