减毒沙门氏菌递呈的TGEV S/N双基因疫苗的构建与免疫诱导规律研究

猪传染性胃肠炎是由TGEV引起的一种猪肠道传染病，给世界养猪业造成巨大损失。粘膜免疫对该病的预防具有重要意义，提高疫苗诱导粘膜免疫应答水平是TGEV疫苗研究的重要方向。本研究拟构建可传递TGEV的S/N双基因的减毒沙门氏菌口服疫苗株，并研究其免疫诱导规律。用RT-PCR扩增TGEV 的S基因和N基因，将S、N基因拼接后插入pVAX1载体，构建表达质粒pVAX-S/N，并将该质粒电转化入减毒沙门氏菌SL7207中，筛选获得口服疫苗菌株SL7207（pVAX-S/N），并对筛选的疫苗株进行生物学特性鉴定；将筛选的疫苗菌株SL7207（pVAX-S/N）口服免疫小鼠和猪，研究其该疫苗的免疫诱导规律（细胞免疫、血清IgG动态规律及亚型鉴定、肠道粘膜抗体sIgA动态规律等）。本研究对猪传染性胃肠炎的预防和控制具有重要的学术和应用价值。

本研究构建了以减毒沙门氏菌为载体的TGEV的S/N双基因口服疫苗，并研究其免疫诱导规律。用RT-PCR扩增S基因抗原区（2.1kb，含A、B、C、D四个主要抗原位点）和N基因（1.2kb），插入真核表达载体构建S、N双基因真核表达质粒，并电转化入减毒沙门氏菌SL7207中筛选获得两种口服疫苗SL7207（pVAX-S/N）和SL7207（pVAD-S/N），研究阐明了双基因口服疫苗的免疫诱导规律。本研究成果：（1）成功构建了共表达S、N基因的融合双基因真核质粒pVAX-S/N和双启动子真核表达质粒pVAXD-N-S；（2）构建了两种双基因口服疫苗SL7207（pVAX-S/N）和SL7207（pVAD-N-S）。结果表明两种双基因疫苗在Kan+抗性下稳定性好，以不同剂量口服免疫小鼠均具有良好的安全性，口服免疫小鼠后第3d即可在肠道检测到S、N两个目基因的转录和表达；体内稳定性显示重组菌在接种小鼠的肝、脾后于4～8周逐渐被机体清除；（3）研究阐明了SL7207（pVAX-S/N）和SL7207（pVAD-N-S）的具有良好的免疫原性，可诱导明显的体液免疫、肠道粘膜免疫和细胞免疫反应：免疫后2周～８周均可检测到明显的血清IgG和肠道粘膜IgA抗体，抗体均在6周达到高峰，双基因疫苗可同时诱导抗S、N两种蛋白的特异性IgG和肠道粘膜IgA抗体；双基因疫苗可诱导明显的明显的外周血和脾脏T淋巴细胞增殖反应；可诱导产生明显的IFN-γ的和低水平的IL-4。双启动子口服疫苗SL7207（pVAD-N-S）比融合双基因口服疫苗SL7207（pVAX-S/N）免疫效果更好。本研究为后续开展TGEV新型口服疫苗的应用研究奠定了基础，对TGEV的预防和控制具有重要的学术和应用价值。