新候选抑癌基因NIPAL1在抑制食管鳞癌细胞增殖和有丝分裂中的分子作用与机制研究

Esophageal squamous cell carcinoma (ESCC) is a common malignant GI cancer in China. The molecular and genetic basis of ESCC is still unknown. Our previous studies performed integrated whole-genome sequencing and transcriptome analysis in four pairs of primary ESCC tissues and their matched nontumor counterparts. We identified a frequent downregulated and mutated gene, NIPAL1 (NIPA Like Domain Containing1) in ESCC. Moreover, our preliminary data showed that NIPAL1 has a strong tumor suppressive role and downregulation of NIPAL1 could promote cell cycle and mitosis in ESCC cells. However, the mechanisms underlying the inhibition of NIPAL1 in ESCC development and progression are almost unknown. In the present study, we aim to further investigate the expression and mutation status of NIPAL1 in clinical ESCC samples; elucidate the gene regulatory mechanism of NIPAL1 downregulation; study the functional roles of NIPAL1 in cell proliferation, cell cycle and mitosis; perform Co-IP and Mass spectrometry to investigate the potential binding proteins of NIPAL1 and their functions involved in inhibiting ESCC cell mitosis; and to investigate the clinical significance of NIPAL1 and its interacting key factors in large ESCC cohort. Our research will not only lay the scientific foundation for elucidating the role of NIPAL1 in the pathogenesis of ESCC, but also provide evidence that NIPAL1 could serve as a novel diagnostic/prognostic marker and therapeutic target for individual treatment of ESCC patients.

食管鳞癌在我国高发且发病机制不明。本项目组前期通过对食管鳞癌及其癌旁正常组织的全基因组和转录组分析、筛选出一个新的食管鳞癌相关突变基因NIPAL1；进一步的预实验结果提示：该基因具有抑癌基因的功能，其表达下调可能通过影响食管鳞癌细胞的有丝分裂发挥促癌作用。然而，NIPAL1基因异常在食管鳞癌发生发展中的确切分子机制不明。本项目将承前启后，拟在一系列的体内和体外实验中，研究并确证NIPAL1在食管鳞癌中的突变及表达情况；解析该基因的失活调控机制；并明确NIPAL1 对食管鳞癌细胞生长、细胞周期、有丝分裂的影响；阐明NIPAL1通过影响癌细胞有丝分裂的抑癌分子机制，并明确与其相互作用的关键信号分子及其下游通路；最后在大病例的食管鳞癌临床样本中，检测并确证NIPAL1及其下游关键调控分子的临床肿瘤学意义和诊疗价值。项目完成将为揭示食管鳞癌的发病机理、发现新的分子诊疗靶点提供部分实验研究的基础。

在中国，食管鳞状细胞癌(Esophageal Squamous Carcinoma, ESCC)是最常见的组织学类型。ESCC因起病隐匿，易侵袭转移和复发，晚期ESCC缺乏有效的防治靶点，其五年生存率小于10%。尽管目前已经发现众多ESCC相关分子改变，如Tp53、SOX2、CDKN2A、CCND1等，但是ESCC发病机制仍不清楚，尚缺乏与ESCC生长和转移相关的特异性诊疗靶点。因此，寻找与ESCC发生发展相关的关键分子，对于改善ESCC患者预后具有重要意义。.本项目组通过对食管鳞癌及正常食管粘膜组织的全基因组和转录组测序分析、TCGA肿瘤数据库和ESCC组织芯片验证，发掘出候选抑癌基因NIPAL1。既往研究发现，NIPAL1编码跨膜转移体，参与Mg2跨膜转运过程。然而NIPAL1在ESCC发生发展中的功能和分子机制仍未见报道，有待进一步探索。本项目组拟应用ESCC组织样本、体内外细胞功能实验和分子生物学实验，探讨RPL39L对食管癌发生发展的影响和分子机制。.首先，我们应用qRT-PCR、WesternBlot、免疫组化等方法，检测NIPAL1在临床组织标本中的表达，结果发现NIPAL1在ESCC组织中表达下调，且NIPAL1低表达与临床不良预后呈正相关。然后，我们应用数据库预测和qRT-PCR验证分析，发现NIPAL1在食管癌中降低可能是受miR-21-5p靶向抑制。其次，我们应用CCK8法细胞增殖实验、平板克隆形成实验、裸鼠皮下成瘤实验等方法，发现NIPAL1可以抑制ESCC细胞的增殖和生长。然后，我们应用GO富集分析和Reactome通路富集分析，发现NIPAL1可以调控食管鳞癌细胞周期进程和纺锤体检查点。然后，我们应用流式细胞术分析食管癌细胞周期进程，发现NIPAL1可以诱发ESCC细胞G2/M期阻滞从而抑制细胞增殖。此外，活细胞成像观察也发现NIPAL1延长了ESCC细胞的有丝分裂时相。.因此，本项目研究发现NIPAL1通过调控纺锤体检查点抑制食管鳞状细胞癌增殖及G2／M期进程。该研究初步阐明NIPAL1参与食管癌发生发展的功能的机制，为寻找食管癌新的治疗靶点和预后判断的标志物提供理论依据。