啤酒高浓酿造条件下酵母胞内ATP代谢的调控机制及其生理功能研究

The ATP metabolism plays a critical role in the increase of fermentation rate, cell activity and beer quality during high gravity (HG) brewing. The beer brewer’s yeast (Saccharomy pastroianus) FBY0095 , in which the P-ATPase and V-ATPase –related genes will be overexpressed using self-cloning techniques, will exhibit stronger enzyme activity of P-ATPase and V-ATPase than the parent and show different activity of ATP metabolism. And the regulatory mechanism of ATP metabolism in these engineering strains will be illustrated, by analyzing the paramters of ATP metabolism (intracellular ATP content and proton motive force ΔP). The fine HG brewing strains will be determined, through comparing fermentation characters, cell activity and beer quality. The physiological function of ATP metabolism will be illustrated by comparing the differences of intracellular metabolic flux, protein expression level, key enzyme activities and adaptability of environment stresses between parent strain and fine HG brewing strains. Thus, results of this project will be of great meaning not only to the development of scientific theories, but also to the industrial applications.

啤酒高浓（High Gravity，HG）酿造过程中酵母胞内ATP代谢在提高发酵速率、细胞活力和产品品质方面起到至关重要的作用。因此，本项目以酿酒酵母（Saccharomyces pastorianus）FBY0095为初始菌株，运用自克隆技术过量表达相关基因提高酵母质膜ATP酶（P-ATPase）和液泡ATP酶（V-ATPase）活性，得到不同ATP代谢活性的改造菌株，结合其ATP代谢参数（胞内ATP、跨膜质子驱动力ΔP），阐明酵母胞内ATP代谢的调控机制；对改造菌株发酵性状、细胞活力和啤酒品质进行评估，确定其中优良的HG酿造菌株；综合运用蛋白组学和代谢通量组学的系统生物学方法，比较初始菌株FBY0095与优良HG酿造菌株的胞内代谢流、蛋白质表达水平、关键酶活的变化，最终阐明HG酿造条件下酵母胞内ATP代谢的生理功能。因此，本研究无论是对学科理论发展，还是对工业应用均具有十分重要的意义。

啤酒高浓酿造（HG）过程中酵母胞内ATP代谢在提高发酵速率、细胞活力和产品品质方面起到至关重要的作用。因此，本项目以酿酒酵母FBY0095为初始菌株，运用自克隆技术过量表达相关基因提高酵母质膜ATP酶活性，得到6株不同ATP代谢活性的改造菌株。运用蛋白组学和代谢通量组学的系统生物学方法，分析胞内代谢流、蛋白质表达水平、关键酶活的变化，最终阐明HG酿造条件下酵母胞内ATP代谢的生理功能。结果表明：（1）改造菌株PMA2和DPF2在含有高浓度糖和乙醇培养基上生长较好。菌株PMA2和DPF2的HG发酵速率比初始菌株FBY0095显著提高，使发酵周期缩短了21.43%。HG发酵结束时，菌株PMA2和DPF2的残糖较低，乙醇浓度较高，细胞活力较高，其生产的啤酒风味明显改善；（2）研究了不同浓度麦汁对酵母FBY0095和优良HG酵母DPF2胞内代谢环境的影响。在HG条件下，DPF2胞内ATP含量和EC水平比FBY0095的低，因此DPF2的代谢活性，糖利用速率和乙醇生成速率均比FBY0095高。相对于FBY0095，在HG酿造条件下DPF细胞膜上H+-ATPase活性较高，胞内H+输出能力升高，从而导致胞内pH升高，防止胞内代谢环境酸化，促进代谢反应进行，并且胞内外pH差异也相应升高，导致酵母细胞对底物的利用能力升高。（3）通过双向电泳质谱技术，分析了HG和NG环境的FBY0095和DPF2的蛋白变化。与FBY0095相比，在DPF2中发现3个显著变化蛋白，分别是3-磷酸甘油醛脱氢酶，丙糖磷酸异构酶和真核翻译起始因子eIF5A；（4）不同浓度糖条件下，分析了FBY0095和DPF2酵母胞内的代谢通量，并分析了酵母胞内糖酵解途径关键酶（己糖激酶、磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶）活性及其对代谢流的定量调控作用。HG条件下，DPF2糖酵解途径的代谢通量和关键酶活均比FBY0095的高。酵母胞内磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶对代谢通量控制作用较强，可认为这两种酶的催化反应是糖酵解流的关键调控步骤。综述所述，本项目对啤酒高浓酿造条件下酵母胞内ATP代谢调控机制及其生理功能进行了充分的研究，最终阐明了酵母细胞对HG环境胁迫的响应机制，进而改良HG酿造酵母的发酵性能，对于啤酒酿造行业具有重要的意义。