基于转录调节及关键代谢组分控制策略的酱油酿造酵母安全高效育种

How to safely and effectively breed the fermentation micrograms for the fermentation quantity is a strict, urgent and scientific problem, especially to strains of gentility back unclear. Using general transcription factors SPT15 from Saccharomyces cerevisiae, the functional complementary of paralogous genes in Zygosaccharomyces rouxii successfully was previously carried out, which suggested the feasibility of heterologous transcriptional modulation. Therefore, by the papers of International Food Safety Assessment of Genetically Modified Organism, safe and highly effective microbial breeding strategy will be constructed in food fermentation based on the transcriptional modulation and analysis of key metabolic components. In this project yeast used in soy-sauce fermentation will be studied. Effect of overexpression of SPT15 on Z. rouxii newly obtained will be researched. The rule of the functional coverage and transcriptional modulation of different SPT15 random mutant libraries from directed evolution will be analyzed. The inferior and superior strains will be obtained by screening the mutant libraries. The key genes with close linkage of advantage traits will be screened by comparative transcriptome. The fermentation phenotypes of the engineered strains constructed using self-cloning Metabolic Engineering will be investigated. Moreover, the safety and control methods will be studied by the analysis of key metabolic components. The success of this project will provide the important strategy for the genetic mechanism of physiological characters, and safe and highly effective microbial breeding, which will cause positive effect on the theory of microbial breeding and the scientific understanding of food safety.

如何安全高效的进行酿造微生物育种提高发酵品质是一个亟需解决的科学问题，对于遗传背景模糊的菌株更是如此。前期利用酿酒酵母全局转录因子ScSPT15成功地功能互补了鲁氏酵母的同源基因，表明异源转录调节的可行性。基于此，本项目拟结合国际基因修饰微生物食品安全评估相关文件，构建基于转录调节及代谢组关键成分监控的酿造微生物安全育种策略。以酱油酿造用酵母为例，研究过表达转录因子对新分离的酱醪结合酵母的影响；探索不同定向进化手段生成SPT15随机突变文库对异源宿主转录调节及功能性覆盖规律。文库筛选获得劣势和优势菌株，通过比较转录组学扫出优势性状紧密连锁关键基因，进行自克隆代谢工程改造，验证所构建的工程菌株的发酵性能，并结合关键代谢组分分析进行安全评估和控制。项目成功实施，将对酿造微生物重要生理性状遗传机制的认识及解决安全、高效育种等问题提供重要策略，将对酿造微生物育种理论与食品安全科学认识产生积极影响。

如何安全高效的进行酿造微生物育种提高发酵品质是一个亟需解决的科学问题，对于遗传背景模糊的菌株更是如此。因此，本项目采用基于转录调节及代谢组关键成分监控的酿造微生物安全育种策略。通过研究发现：酱油发酵过程中添加的S酵母在甲基磺酸乙酯（EMS）浓度为1%时经过55min的诱变条件下，得到1株具有遗传稳定性的尿嘧啶营养缺陷型菌株命名为WM。因为S酵母的细胞壁较厚且含有较多的几丁质，所以进行电转化条件的优化，得到最佳电转化条件为DNA质量为0.1μg、Li+浓度为60mM、电压为1400V。以酿酒酵母的全局转录因子SPT15为模板，从温度、Mg2+浓度及dATP、dTTP、dCTP和dGTP几个方面进行易错PCR反应，得到SPT15基因突变库。进而得到SPT15基因突变质粒库YEplac195-P-T-SPT15，将其导入酿酒酵母W303中，得到耐盐的菌株。经PCR扩增后测序，对其突变位置进行基因分析。将含有该突变基因的质粒导入WM菌株中，分别得到菌株WM+G（G代表0、1、2、3、4表示不同的质粒）。继而，分析构建优良菌株的耐盐机制。研究发现耐盐性能由高到低的顺序为酵母WM+4、WM+1、WM+2、WM+3、WM+0。因此，测定耐盐性最强的菌株WM+4的基因组信息，其基因组大小为9.7 Mbp，包含4711个基因，该菌株具有很强的氨基酸合成能力。对不同盐度不同时间条件下WM+4的胞内外甘油和海藻糖的含量变化分析发现，甘油和海藻糖相辅相成共同提高了酵母的耐高渗能力。利用实时定量PCR考察了四个关键基因HOG1、GPD1、TPS1和TPS2不同时间条件下的表达量变化情况，证明高盐环境下转录因子SPT15诱导了上述这四个基因的表达。最后，选择耐高温和耐盐性能都较好且具有遗传稳定性的优良菌株酵母应用于低盐固态发酵工艺和高盐稀态发酵工艺进行发酵。根据其各种理化指标和经济指标判定发酵性能依次为WM+4>WM+1>WM+0>WM。此外，设计出两种周期较短的酱油发酵新工艺Ⅰ和酱油发酵新工艺Ⅱ，结果表明新工艺Ⅰ发酵酱油的品质比新工艺Ⅱ好，添加酵母WM+4的发酵组生产的酱油质量最好。本项目的成功实施，为解决酿造微生物重要生理性状遗传机制认识及安全、高效育种等科学问题提供重要策略。