衣藻脂肪酸转运蛋白CrFAX1/2与CrABCA2协同调控脂质代谢的机制研究

The lipid metabolism’s research is very useful for breeding oil-rich strains of microalgae, producing biofuels and other high-value products. Fatty acid transporters mediate the transport of fatty acids and acyl lipids between chloroplasts and endoplasmic reticulum. The transmembrane-transport of lipids mediated by transporters plays an important role in lipid synthesis, but its molecular mechanism is still unclear. We recently discovered a new endoplasmic reticulum fatty acid transporter CrABCA2 in Chlamydomonas reinhardtii. In order to explore the synergistic effect of CrABCA2 and known chloroplast fatty acid transporter proteins CrFAX1 and CrFAX2 on fatty acid transmembrane-transport and lipid synthesis, this project intends to verify whether the synergistic effect can improve fatty acid transporter level by co-overexpression of CrABCA2，CrFAX1 and CrFAX2, and thus promote oil synthesis. We will explore the synergistic effect between fatty acid transporters and reveal their effects on lipid biosynthesis and their response to stress condition. This project will provide a new strategy for improving the oil production capacity of microalgae and plants, and pave the way for the efficient production of biofuel.

微藻脂质代谢调控机制的研究对选育优良微藻富油品系、生产生物燃料及其它高价值产品具有重要意义。脂肪酸转运蛋白是将脂肪酸和酰基脂质在叶绿体和内质网之间转运的关键蛋白，其介导的脂质跨膜运输对油脂合成有重要影响，但其分子机制尚不清楚。申请人最近在莱茵衣藻中发现了一个新的内质网脂肪酸转运蛋白CrABCA2，为了探究其与已知叶绿体脂肪酸转运蛋白CrFAX1和CrFAX2之间的协同作用对脂肪酸跨膜转运及油脂合成的影响，本项目拟通过共同过表达CrABCA2、CrFAX1和CrFAX2的方法，验证其协同作用是否能提高脂肪酸转运水平，并最终促进油脂合成。探索各脂肪酸转运蛋白之间协同作用对油脂合成的调控机理，及其对逆境生理的响应机制。本项目研究将为提高微藻及植物产油能力提供新策略，为高效生产生物燃油奠定理论基础。

脂肪酸转运蛋白是将脂肪酸和酰基脂质在叶绿体和内质网之间转运的关键蛋白，其介导的脂质跨膜运输对油脂合成有重要影响，但其分子机制尚不清楚。在本项目中，申请人在莱茵衣藻中鉴定了一个新的位于内质网的脂肪酸转运蛋白CrABCA2，并探究了其与叶绿体定位的脂肪酸转运蛋白(FAX1和FAX2)之间的协同作用对油脂(TAG)合成的影响及调控机制。本项目首先构建了高效表达载体，经筛选鉴定分别获得了单一过表达脂肪酸转运蛋白的突变体(FAX1/FAX2-OE和ABCA2-OE)，共表达两种脂肪酸转运蛋白的突变体FAX1/FAX2/ABCA2-OE。在标准培养条件下，FAX1/FAX2/ABCA2-OE中TAG含量比野生藻株提高约200%，与FAX1/FAX2-OE相比TAG含量增加56%。该结果表明，共同过表达脂肪酸转运蛋白对TAG的合成有累加效应，显著提高了细胞内TAG含量。进一步研究发现，FAX1/FAX2/ABCA2-OE突变体TAG含量提高的原因并非是自身膜脂组分的含量的减少。相反，FAX1/FAX2/ABCA2-OE膜脂含量提高了61%。对脂质合成贡献率研究发现，膜脂对FAX1/FAX2/ABCA2-OE脂质合成的贡献率最高。膜脂中主要的多聚不饱和脂肪酸对总脂肪酸和TAG合成总积累贡献率均超过40%。基因表达分析发现，FAX1/FAX2/ABCA2-OE中PDAT1和PGD1的表达水平分别提高了2倍和7倍；并且参与TAG合成的关键基因，如DGTT1、DGTT3和DGTT5的表达水平也显著增加。这表明FAX1/FAX2/ABCA2同时过表达不仅促进了TAG和膜脂的合成能力，同时也加速了膜脂组分向TAG合成转化，从而造成细胞内TAG的大量合成和积累。然而，在缺氮培养的条件下，虽然FAX1/FAX2/ABCA2-OE突变体中油脂的含量与对照藻株相比也显著增多，但油脂的积累的主要原因是油脂合成能力的增加而非膜脂转化。生理分析发现，FAX1/FAX2/ABCA2-OE细胞体积显著增大，生物量明显提高，这可能由于其体内油脂的大量积累有关。因此，本项目研究表明，FAX1/FAX2/ABCA2同时过表达对脂质的合成有协同效应，比单一的脂肪酸转运蛋白过表达突变体具有更强的储能物质合成能力。本研究为增加微藻中储能物质和脂肪酸衍生高附加值产物的生产提供了新的策略和奠定了理论基础。