多基因调控对衣藻油脂合成代谢的影响

Microalgae are considered as one of the most promising feedstocks for biofuels. CO2 biofixation by microalgae via photosynthesis to synthesize the lipid droplet and the biodiesel is further produced by trans-esterification of triacyglycerol (TAG). Microalgae screening and genetic engineering modification play the key role in the microalgae biofuels, and genetic engineering modification strategy is the effective method. This project focuses on metabolic pathway modification of fatty acid biosynthesis in Chlamydomonas reinhardtii, manipulate lipid metabolic pathway to create a channeling of metabolites to lipid biosynthesis by multiple genetic engineering approaches. We emphasis on generating knockouts of the genes encoding phosphoenolpyruvate carboxylase (PEPC) by homologous recombination to enhance the carbon metabolism in to TAG biosynthesis; try to down-regulated of PEPC by RNA interference and over-expression of DGAT in the mutant of PEPC RNAi to regulate metabolic fluxes to lipid accumulation. Promoters of some rate-limiting enzymes (PEPC、ACCase、DGAT、PDAT) will be cloned from genome DNA in C. reinhardtii, and functional elements of regulating transcription are identified. This project based on the metabolic pathway modification of fatty acid biosynthesis in C. reinhardtii, will make a foundation for further understanding of the promotion mechanism of lipid biosynthesis and genetic engineering of green microalgae for biodiesel production by regulating of sticking point in the lipid metabolic pathway to enhance lipid biosynthesis.

微藻通过光合作用固定二氧化碳形成油脂，然后可被转酯化为生物柴油，是目前最具潜力的可持续生物能源之一。藻种的选育和基因工程改造是微藻生物柴油研究的核心。本项目选择模式生物莱茵衣藻作为研究对象，根据细胞内的碳流量代谢途径，寻找影响脂类合成的关键节点，采用多种基因操纵的方法对脂肪酸代谢途径进行改造以加强微藻的油脂积累。重点应用同源重组的方法敲除核基因组上影响碳流量分配到脂类合成的基因ppc；尝试性的下调PEPC活性的同时过表达DGAT加强TAG合成，在减弱碳流向非脂类合成的同时转而加强碳流向脂类的合成。克隆关键基因（PEPC、ACCase、DGAT、PDAT）的启动子，初步寻找其调控转录活性的作用元件。该研究在对莱茵衣藻脂肪酸代谢途径改造的同时，调控关键节点加强碳流量分配到脂类的合成，从而更深入的探讨脂类的合成途径，为准确进行产油微藻尤其是绿藻的基因工程改造奠定基础并提供理论指导。

本项目针对微藻生物柴油研究的核心问题，藻种的选育和基因工程改造，选择模式生物莱茵衣藻作为研究对象，根据细胞内的碳流量代谢途径，寻找影响脂类合成的关键节点，采用多种基因操纵的方法对脂肪酸代谢途径进行改造以加强微藻的油脂积累。首先尝试性的应用同源重组的方法敲除磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因（PEPC），推测会加强碳流向脂类的积累。下载莱茵衣藻不同分子质量的PEPC1（GenBank登录号：AY517644.1）和PEPC2（GenBank登录号：AY517643.1）。的序列作为参考设计引物进行聚合酶链式反应扩增，分别获得ppc1和ppc2的约500 bp长度的左侧同源序列和右侧同源序列。构建重组载体，玻璃珠法转化莱茵衣藻CC400和CC406藻株，应用潮霉素抗性的固体培养基筛选转入外源片段的莱茵衣藻转化株。筛选得到的120个转化株中进行验证，发现均没有发生有效的同源重组，未能将靶基因敲除，但是从基因组中能够扩增得到转入的外源片段，说明转入的片段以非同源重组的形式整合到基因组上且能够在基因组上稳定存在，伴随莱茵衣藻细胞的传代培养仍然稳定的存在。将ppc1和ppc2的同源片段长度增大到1 kb后，筛选得到124个转化株，仍旧没有发生有效的同源重组，加长的外源片段以非同源重组的形式整合到基因组上，转化率较短同源片段的低。然后构建了DGAT2b和DGAT2e的过表达载体，筛选得到过表达藻株，在此基础上构建PEPC的RNA沉默载体并转化，筛选得到双基因操纵的转化藻株。对淀粉合成受限突变株CC4326（AGPase大亚基失活）和突变株CC4334（异淀粉酶失活）经过28个循环的实验室适应性进化培养后，CC4324、CC4326和CC4334等进化后藻株的生物量较出发藻株分别提高了17%、33%和48%，且进化后藻株的Fv/Fm值较出发藻株升高。氮饥饿培养下，进化后藻株的叶绿素荧光参数对氮饥饿信号响应更敏感。CC4326的总脂含量从出发藻株的32%增长到进化后藻株的36.7%；CC4334的总脂含量从出发藻株的24.27%增长到进化后藻株的44.67%。实验室适应性进化的策略可以作为藻种选育的一种新方法，与大规模藻种筛选相比，工作量少，效率高，能够有效的筛选出生物量大、油脂产量高的藻种。因此，适应进化在微藻生物燃料开发中有着广阔的应用前景，并为微藻生物学研究提供基础。