以自噬为靶点调控肾小管上皮细胞参与移植肾间质纤维化形成的作用机制及干预研究

Renal allograft interstitial fibrosis is the key factor affecting the long-term survival of renal transplanted recipients, but the mechanism is still unknown. Our previous studies have shown that renal tubular epithelial-mesenchymal transdifferentiation (renal tubular EMT) induced by tumor necrosis factor-alpha (TNF-alpha) plays an important role in the formation of renal allograft interstitial fibrosis. Recently, we found that autophagy significantly increased in renal tubular epithelial cells in patients with renal allograft interstitial fibrosis. While in vitro studies showed that TNF-alpha could inhibit the expression of autophagy related protein——p62 in human renal tubular epithelial cells. However, the exact role and mechanism of autophagy in formation of renal allograft interstitial fibrosis has never been reported at home and abroad. Accordingly, we put forward the hypothesis: disorder of autophagy activity maybe play a critical role in the formation of renal allograft interstitial fibrosis through promoting renal tubular EMT. To verify this hypothesis, this project will investigate the effects and mechanisms of autophagy in the formation of renal allograft interstitial fibrosis mediated by TNF-alpha through a rat renal allograft transplantation model and the human renal tubular epithelial cells model. On this basis, we will in-depth study the effects and mechanisms of everolimus in the formation of renal allograft interstitial fibrosis. The expected results of this study will provide new clues and targets for prevention and treatment of renal allograft interstitial fibrosis from the regulation of autophagy activity point of view.

移植肾间质纤维化是影响肾移植受者长期存活的关键因素，其机制至今不明。我们既往研究证实肿瘤坏死因子-alpha（TNF-a）可通过诱导肾小管上皮细胞-间充质细胞转分化（肾小管EMT）发生进而在移植肾间质纤维化形成中起重要作用。新近我们又发现在移植肾间质纤维化患者肾小管上皮细胞中自噬活性明显增加，而TNF-a却可抑制人肾小管上皮细胞中自噬相关蛋白p62表达。但对于自噬在移植肾间质纤维化形成中的确切作用及机制迄今国内外尚未见报道。据此我们提出：自噬活性失调可能通过调控肾小管EMT发生进而在移植肾间质纤维化形成中起关键作用。为验证该假说，本课题拟通过同种异体肾移植大鼠和正常人肾小管上皮细胞模型，以TNF-a为介质，探讨自噬在移植肾间质纤维化形成中的作用及机制。并在此基础上，深入探讨依维莫司在其中的防治作用及机制。本课题预期成果将为从调控自噬角度研发防治移植肾间质纤维化形成的措施提供新线索和靶标。

移植肾间质纤维化是影响移植肾长期存活的关键因素，其机制至今不明。近年来，自噬在各脏器纤维化中的作用受到广泛关注。我们既往研究证实，肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）可通过诱导肾小管上皮细胞-间充质细胞转分化（Epithelial- mesenchymal transition，EMT）的发生，进而在移植肾间质纤维化形成中起到重要作用。但自噬在肾小管EMT发生和移植肾间质纤维化形成中的作用至今尚不清楚。本研究分别选用慢性移植肾失功（Chronic renal allograft dysfunction，CAD）患者和大鼠同种异体肾移植模型的移植肾组织、以及TNF-α处理的人肾小管上皮细胞（human kidney tubular epthelial cell-2，HK-2）细胞为体内外研究对象，运用二代测序、基因转染等技术，并通过蛋白免疫印迹、实时定量RT-PCR、透射电镜扫描等方法深入探讨自噬在移植肾间质纤维化形成中的作用及相关机制。并在此基础上，进一步探讨依维莫司在其中的防治作用及可能机制。在本研究中，我们首先在CAD患者与大鼠肾移植动物模型中证实自噬活性激活与肾小管EMT发生和移植肾间质纤维化形成密切相关；其次，在人HK-2细胞中证实TNF-α可通过调控Erk1/2及JNK信号通路活性激活自噬，进而抑制TNF-α的促肾小管EMT发生和移植肾间质纤维化形成的作用。第三，本研究还证实依维莫司干预可通过激活自噬活性，抑制肾小管EMT发生，进而显著延缓大鼠移植肾间质纤维化进展和减轻移植肾功能损害发生；此外，我们还进一步在体内外证实依维莫司对抗移植肾间质纤维化形成的作用除与其激活自噬相关外，还与其调节NF-κB信号通路活性有关。本项目的研究结果首次提出调控自噬活性可能成为防治移植肾间质纤维化形成的新靶标，而且首次在肾移植这一特定病理环境中证实依维莫司可通过调控自噬及NF-κB信号通路活性抑制肾小管EMT发生，进而阻止移植肾间质纤维化形成。总之，本项目的研究结果不仅有助于从分子水平深入解析移植肾间质纤维化形成的机制，扩展人们对依维莫司在肾移植领域中应用及相关机制的认识；而且为将来以自噬为靶点，从调控蛋白质降解角度研发阻止移植肾间质纤维化形成的防治措施提供新线索和靶标。