日本沼虾卵黄蛋白原合成代谢分子调控机制研究

卵生脊椎动体内VTG合成受VTG-E2-ER-HSP90分子调控轴调控，甲壳动物VTG合成是否具有同样的调节机制尚不明了，近年来的研究报道显示HSP90和E2与甲壳动物VTG的合成有关。日本沼虾在养殖过程中出现了抱卵个体"小型化"的现象，这使该虾的商品价格大大降低，制约了该虾的繁殖与育种。本项目拟通过对该虾VTG、HSP90和ERR基因的克隆、HSP90和ERR抗原和抗体的制备，采用QRT-PCR、原位杂交和ELISA等方法，测定在卵巢发育过程中以及E2、E2拮抗物、HSP90抑制剂分别注射后VTG、HSP90、ERR和E2表达量和表达位置的变化。另外通过软件对HSP90和ER序列结合位点进行分析，并开展免疫共沉淀实验，研究两者之间的受体结合位点情况。该项目系统研究了日本沼虾卵巢发育过程中VTG、HSP90、E2、ERR调节轴的作用，将为日本沼虾生产上抱卵个体"小型化"的解决提供理论参考。

近年来日本沼虾出现了母亲本发育提前、个体小型化的“性早熟”的资源退化现象，为了研究“性早熟”的原因和机理，本项目开创性地开展了日本沼虾卵黄蛋白原（MnVg）的代谢调控以及类固醇激素和BPA对卵巢发育的影响研究。研究内容：采用RACE技术克隆卵巢发育过程中与MnVg代谢相关基因；采用QPCR测定上述基因在卵巢发育过程中的表达量；采用ELISA方法测定卵巢、肝胰腺和胸神经节中类固醇激素的含量；通过体外注射E2，研究其对卵巢发育相关指标的影响；比较观察了卵巢发育过程中胸神经节组织结构和肝胰腺超微结构的变化；研究BPA对日本沼虾繁殖机能的影响。研究结果：①卵巢发育至V期时，GSI达到最大值，HSI降至最低值; ②克隆获得了日本沼虾1273bpMnVg大片段、2684bpMnHSP90全长。MnVg和MnHSP90在胸神经节中表达量均较高；卵巢发育至Ⅳ期MnVg和MnHSP90表达量达到峰值；肝胰腺中MnVg和MnHSP90表达量均显著高于同期卵巢。③克隆获得了与MnVg水解代谢相关的1710bpMnCL全长和1643bpMnCB全长。MnCL和MnCB均由信号肽、前导肽和成熟肽三部分组成。MnCL和MnCB在心脏、肌肉、肝胰腺和胸神经节中表达量均较高；卵巢发育至Ⅲ期MnCB的表达量显著增加，Ⅳ期MnCL表达量显著增加。④在卵巢发育过程中，IV期卵巢和VI-1期肝胰腺中E2含量达到峰值，V期卵巢和肝胰腺中P含量达到峰值。⑤注射0.5 μg.g-1E210d后虾体肝胰腺中与卵巢发育相关脂肪酸的含量显著增加，而且肝胰腺中B细胞体积增大。⑥在卵黄发生过程中，肝胰腺细胞中可以看到卵黄颗粒的形成和分泌过程；卵巢发育至Ⅲ期，胸神经节中I型细胞数量减少，II型细胞数量增多。⑦BPA对日本沼虾24hLC50、48hLC50、安全浓度分别为80.59、63.90和12.06mg.L-1。浸泡在12.06mg.L-1BPA中10d后卵巢中MnVg和MnHSP90基因表达量显著提高。本研究首次从肝胰腺形态、超微结构、生化组分、基因表达综合考察确定了肝胰腺在日本沼虾卵巢发育过程中的重要作用；克隆获得了与日本沼虾卵巢发育相关的基因全长，并初步明确了它们在日本沼虾卵黄蛋白原代谢调控的作用，为后续这些基因的功能研究奠定了基础；初步明确了E2、P和BPA在日本沼虾卵巢发育过程中的作用。