基于肥大细胞介导下的大黄促进粘液分泌和粘膜屏障功能的研究

Colonic mucus secretion abnormality is an important cause of constipation. The purgative effect of Rhubarb can relieve constipation, but curative effect of long and short term is different and its mechanism is not clear. .Our previous studies showed that long-term use of rhubarb could lead to reduced sensitivity to the drug, but the short-term effect is significant as well. Base on the preliminary investigation, in order to evaluate the effect of rhubarb on colonic mucus secretion and membrane barrier , the function of goblet cells and mucus secretion was studied with the short-circuit current and ion concentration synchronous detection technology on the rat constipation model. In order to conform the permeability of mucus and mucosa on the some substance, the sugar molecular probes and fluorescent lamps marker were used. To research the regulation mechanism of rhubarb on bidirectional mucus secretion, it need to using immunofluorescence and Western blotting so as to indicate the change of tight junction proteins, Fn, MMP-9 and MMP-2. In order to study the effect of the mast cells on ion secretion and regulation mucus barrier in colon the directional gene knockout technology will be used and the mechanism of rhubarb on the loosening bowel to relieve constipation researched ..The purpose of the study is to identify our hypothesis“ Rhubarb could promote colonic mucus secretion and mucosal barrier protective role, which has been dependence the mast cells and nerve pathway”. All the investigation is to reveal the advantages of the short-term use of Rhubarb and decrease side effects of the long-term use. We wish it could provide a theoretical basis for the clinical researchers.

结肠粘液分泌异常是导致便秘的重要原因。大黄的泻下作用可缓解便秘，但长期和短期使用疗效差异明显，且机制不清。本课题组前期研究发现，长期使用大黄可导致动物对药物的敏感性降低，但短期效果显著。本研究拟在此前期研究的基础上，通过制备大鼠便秘模型，运用短路电流和离子浓度同步检测等技术，进行杯状细胞功能检测和粘液分泌测定，以探讨大黄对结肠粘液分泌和膜屏障变化调节；采用糖分子探针和荧光球标记技术测定粘液和粘膜的通透性；使用免疫荧光和蛋白印记，以结肠紧密连接蛋白和Fn、MMP-9和MMP-2变化为指标，探讨大黄对粘液分泌的双向调控作用机制；利用定向敲除基因技术，观察肥大细胞对离子分泌、粘液屏障的调节作用，探讨肥大细胞在大黄润肠通便中的作用。通过研究证明我们的假说：“大黄促进结肠粘液分泌和粘膜屏障保护的作用，具有肥大细胞和神经通路依赖性”，以揭示大黄短期使用的优势，为降低长期使用大黄毒副作用提供理论依据。

便秘是一种常见的临床症状，主要特征表现为排便次数减少、排便困难、粪便干结等，严重影响患者的生活质量。早期预防和合理治疗可有效降低或改善便秘的发生，提高患者生活质量，具有重要意义。大黄作为传统中药，在临床上以单方或复方治疗便秘。研究报道，大黄可通过提高肠道动力、促进离子分泌和减少水分吸收等机制发挥泻下的功效。黏液是影响排便过程的重要因素，其与肠道健康状况的关系密不可分。黏液由杯状细胞合成及分泌，肠道黏液的分泌因机体反应而做出相应改变。大黄可缓解便秘，是否通过影响黏液的作用机制尚未明确，本研究致力于大黄对结肠黏液分泌的影响及其机制的研究。.选用C57BL/6N雄性小鼠，使用地酚诺酯灌胃制备便秘模型；应用过碘酸雪夫（PAS）染色检测结肠黏液的分布；应用IHF方法检测结肠黏蛋白Muc2、calnexin（CANX）和chymotrypsin的表达；结合TEM观察结肠杯状细胞及黏液的超微结构；应用Western blot探讨大黄对CANX 和tryptase的影响；结合RT-PCR检测Bip、Xbpp1和CHOP Mrna变化,探讨内质网应激； ELISA检测在结肠中Muc2、TFF3、乙酰胆碱、组胺和趋化因子CCL5含量的变化；应用GC-MS检测粪便脂肪酸含量的变化，使用16S rDNA探寻肠道菌群在此过程中的变化。.重要结果：便秘模型动物的结肠内黏液层与对照组相比变薄且不完整，排便量和粪便含水量减少，结肠黏液分泌减少，杯状细胞内黏液含量增多，结肠肌层厚度和隐窝长度增加，而给予大黄治疗后促进结肠黏液的分泌，肌层厚度和隐窝长度恢复至正常水平；且结肠黏膜杯状细胞内Bip、Xbp1和CHOP mRNA表达上调；同时肥大细胞在结肠组织的聚集，激活释放类胰蛋白酶、糜蛋白酶、组织胺和乙酰胆碱的含量增多；大黄使肠道菌群的多样性和粪便中短链脂肪酸含量改变。.大黄通过引起免疫细胞在结肠聚集释放生物活性物质、乙酰胆碱释放增加，促进杯状细胞结肠黏液的分泌，同时诱导结肠黏膜杯状细胞内质网应激反应以及肠道菌群多样性和肠道微生物代谢的改变，从而改善便秘。