促肾上腺皮质激素释放因子（CRF）对大鼠海马神经元结构和功能的直接效应及机制研究

Chronic stress has been implicated in the onset of affective disorders and neurodegenerative diseases. During chronic stress corticotropin-releasing factor (CRF) impacted organism function through hypothalamic-pituitary-adrenal axis (HPA axis).Recently it has to be emphasized that CRF receptors are widely expressed in central nervous system. And average CRF levels in brain are significantlyelevated when exposed to stressors.CRF can injure neuron directly via CRF receptor 1 besides HPA axis.Our preliminary experiments found that CRF was associated with structural changes in newborn rat hippocampal neurons, including reduced dendritic arborization length and total number. And CRF induced dendritic atrophy was reversed by CRFR1 antagonist. MAP2 protein amount and the phosphorylation were increased obviously.But the molecular mechanism about CRF inducing direct injury effect on neuron has been poorly understood. And influence of CRF on central neuron synapse function has not been elucidated fully. So with regard to molecular mechanism about hippocampal structure plasticity we will utilize Western blotting, immunochemistry and confocal microscope etc technique to determine signal pathway and key protein. And regarding synapse function plasticity we will adopt electrophysiological technique to study LTP and excitory and inhibitory synaptic transmission. Our results will highlight new theory and experimental proof of molecular mechanism about neural injury mediated by chronic stress ultimately.

慢性应激与情感障碍性疾病和神经退行性病变密切相关。各种引发慢性应激的因素，通过刺激CRF的释放，调控HPA轴功能，在机体对慢性应激方面起重要作用。近年研究发现，CRF受体广泛分布于中枢神经系统，机体产生应激反应时，脑内CRF显著升高。除通过HPA轴发挥作用外，CRF还可直接造成中枢神经元损伤。我们前期工作发现，CRF缩短海马神经元树突总长度；选择性拮抗CRFR1可对抗树突萎缩；MAP2蛋白表达水平下调，磷酸化水平上调。目前CRF直接损伤中枢神经元的分子机制仍不明，CRF对中枢神经元功能影响的机制也不清楚。本项目拟利用Western、细胞免疫组化和激光共聚焦显微镜等技术，通过观察CRF对MAP2的影响，确定CRF调节海马神经元结构可塑性变化的信号通路和关键蛋白分子；并用细胞电生理手段，研究CRF对海马神经元突触活动的影响，为最终阐明慢性应激损伤中枢神经元的分子机制提供新理论和实验依据。

研究思路基本按照原计划进行，总体来讲，前期研究CRF对海马神经元结构的影响及其受体后信号机制进展比较顺利，也取得了一系列有意义的结果。我们证明：1，2 uM CRF可引起海马神经元树突密度减少，且此作用能被CRFR1特异性阻断剂（DMP696）明显拮抗。2，CRF可浓度依赖性抑制海马神经元活力，0.02 uM、0.2 uM和2 uM CRF处理组神经元活力依次为94.0±1.3%、71.6±3.1%和72.6±3.5% （n=3，P ＜0.001）。3， 2 uM CRF可下调海马神经元MAP2和P-CREB蛋白水平表达，上调PSD95和P-Tau蛋白水平表达；且两者变化均能被DMP696拮抗；PKA特异性抑制剂H89可拮抗CRF引起的MAP2蛋白表达水平下调及P-Tau蛋白水平上调。4，RT-PCR结果显示：CRF处理海马神经元后， PSD95和MAP2 mRNA表达水平的变化与蛋白水平的变化一致，而Tau与CREB的mRNA表达水平无明显变化。5，cAMP释放实验表明CRF可浓度依赖性的调节海马神经元cAMP含量的变化，且DMP696可减少2 uM CRF引起的海马神经元cAMP释放水平。后期在利用脑片膜片钳技术进行CRF对海马神经元功能影响的研究过程中遭遇了技术困难。具体来讲，多次诱发LTP均告失败，而且记录到的sEPSCs、mEPSCs、IPSCs和mIPSCs在实验中不能坚持很长时间，因此得不到可靠的CRF对突触后电流的结果。考虑脑片质量可能是主要的影响因素，因为海马脑片对缺氧以及温度要求极高，条件稍有不适，就会造成脑片神经元肿胀，神经元质量急剧下降。即使形成神经元高阻封接，破膜之后依旧不能坚持很长时间，因此没有拿到可靠的实验数据。本研究尽管遇到了一些技术困难，最终还是按时高质量完成了部分预定目标，揭示了CRF对海马神经元结构的直接效应及相关信号分子的改变，为CRFR1介导的CRF引起海马神经元损伤的理论提供了新的实验依据，同时建立了CRFR1受体拮抗剂筛选细胞模型。