ROS/MAPK调控TR4在DEHP诱导小鼠生精细胞凋亡中的作用

Di（2-ethylhexyl） phthalate (DEHP) is a global environmental pollutant and male reproductive toxicant. DEHP can induce germ cell apoptosis. Testicular orphan receptor 4(TR4) regulated by ROS/MAPK signaling pathway participates in cell apoptosis via regulating Bcl-2 expression. However, the mechanism by which DEHP exposure causes male reproductive toxicity remains unknown. In order to discover the effect of DEHP on the molecular mechanism of functional disorder of male reproduction，DEHP is investigated in male mice. Considering the orphan nuclear receptor TR4 regulated by ROS/MAPK signaling pathway as key point,the techniques of flow cytometry,western blot,real-time PCR and electron microscope are applied to observe the effects of DEHP on germ cell apoptosis and TR4 expression in male mice from the whole animal and cell molecular level.Furthermore,we try to use antioxidants，special MAPK inhibitors and TR4 activators to study the role of TR4 in germ cell apoptosis induced by DEHP, illustrate the possible molecular mechanism and functional targets of germ cell apoptosis. The study will provide the new theory basis for mechanism research of male reproductive toxicity induced by other environmental endocrine disruptors.

塑化剂DEHP是一种危害性极大的全球性环境污染物，具有雄性生殖毒性，可诱导生精细胞凋亡，但其机制尚不清楚。研究表明，ROS/MAPK信号通路调控的孤核受体TR4可通过调节Bcl-2表达而参与细胞凋亡。本研究拟以DEHP为受试物，CD1雄性小鼠为研究对象，ROS/MAPK信号通路调控孤核受体TR4为研究重点，揭示DEHP致小鼠生精细胞凋亡的分子机制为目标，采用体外细胞培养和动物实验相结合的研究方案，应用流式细胞术、Western blot、Real-time PCR及电镜等方法，从整体动物、细胞和分子水平探讨DEHP对小鼠生精细胞凋亡及孤核受体TR4的影响，利用抗氧化剂、特异性MAPK抑制剂及TR4激活剂研究TR4在DEHP诱导生精细胞凋亡中的作用，揭示DEHP诱导生精细胞凋亡的可能机制及作用靶点。本研究将为其他环境内分泌干扰物致雄性生殖毒性机制研究提供新的理论依据。

邻苯二甲酸酯类（PAEs）是目前普遍使用的塑化剂，PAEs与产品基质间为非共价结合，容易从产品中释放进入周围环境，污染空气、土壤、水甚至食物，是一种全球性污染物。在PAEs中，以邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（DEHP）的用量最大。DEHP可干扰人和动物的内分泌系统，具有抗雄性激素作用，是一种环境内分泌干扰物（EDCs）。DEHP染毒可导致睾丸萎缩，精子密度及活力降低，生精细胞凋亡等，但机制尚不完全清楚。本研究以DEHP为受试物，GC-2 spd细胞和青春前期、青春期大鼠为研究对象，采用体外细胞培养和动物实验相结合的研究方案，应用流式细胞术、Western blotting、Real-time PCR等方法，从整体动物、细胞和分子水平探讨DEHP诱导生精细胞凋亡的分子机制。结果显示，与溶剂对照组比较，200 μmol/L DEHP染毒组GC-2 spd细胞的存活率下降（P<0.05），100、200 μmol/L DEHP染毒组GC-2 spd细胞的凋亡率均升高（P<0.05）；DEHP染毒可以引起GC-2 spd细胞SOD、GSH-PX活性下降（P<0.05）；GC-2 spd细胞中TR4、Bax、 Cyt-c、FasL、caspase-3、-8、-9、JAZF1等mRNA表达升高（P<0.05），Bcl-2基因mRNA表达下降（P<0.05）；GC-2 spd细胞中TR4、Bcl-2、procaspase-3、-8、-9等蛋白表达下降（P<0.05），Bax、 Cyt-c、FasL等蛋白表达升高（P<0.05）；青春前期大鼠染毒DEHP 28天后，精子密度、精子活动率、活动精子密度下降，睾丸萎缩，睾丸组织形态学紊乱；青春期大鼠染毒DEHP 28天后，睾丸组织细胞凋亡指数增加，引发睾丸组织氧化应激，睾丸中锌含量下降；此外，DEHP的主要代谢物MEHP可致GC-2 spd细胞活力下降，凋亡率增加。总之，我们的结果表明，DEHP可通过TR4介导的线粒体通路以及氧化应激介导的FasL通路诱导生精细胞凋亡。