EphB4受体对脑卒中后神经干细胞增殖、分化的作用及机制研究

Stroke is a leading cause of disability and mortality worldwide. It is due to neuronal death and thereby irreversed neurological dysfunction after cerebral ischemia. Since neural stem cells renewal is regulated by a complex network, how to find a new beneficial way to promote neurogenesis is thought to be the difficulty in the development of neurorestorative therapy for stroke..The aim of this study is to demonstrate the role of EphB4 receptor in the neural stem cells proliferation and differentiation, in vitro and in vivo. ① Construct EphB4 overexpression model or silence EphB4 expression with siRNA on human embryonic neural stem cells, and then observe the impact on the cell proliferation, differentiation and apoptosis by immunofluoresence detection with BrdU, GFAP, TUNEL and so on. To indicate possible mechanism of EphB4 in regulating cell proliferation, the relationship between EphB4 and downstream proteins Abl, CyclinD1 will be discussed by using protein inhibitor. ② Establish an EphB4 gene knock-out animal model, and determine that if EphB4 is associated with neurogenesis induced by cerebral ischemia or electroconvulsive stimulation, as well as the maturation of new born cells and synaptic plasticity. Effects of EphB4 knock-out on neurological function and infarct volume after ischemic stroke will also be clarified..EphB4 may emerge as a new signaling molecule for regulating the performance of neural stem cell, and this study will provide a novel and promising candidate approach for the neurorestoration treatment of stroke.

脑卒中是危害人类健康的第三大疾病，其高致残率和致死率归因于神经元死亡导致的永久性神经功能缺陷。而神经再生受复杂的网络调控，发现促进神经再生修复的新靶点和新方法，是目前脑卒中神经康复治疗的难点。.本研究从细胞和动物2个水平研究EphB4对神经干细胞增殖、分化的作用和分子机制：①构建人胚胎神经干细胞EphB4基因沉默和过表达模型，BrdU、GFAP、TUNEL等荧光染色观察EphB4对神经干细胞增殖、分化、凋亡的影响；使用蛋白抑制剂探讨EphB4与下游Abl、CyclinD1的关系；②构建EphB4基因敲除小鼠，给予脑缺血或电刺激，观察EphB4对神经干细胞增殖、新生细胞成熟以及树突棘密度等突触可塑性的影响，并通过行为学评分和核磁共振成像等观察EphB4基因敲除对脑卒中后神经功能和梗死体积的作用。.本研究将发现一个新的神经干细胞调节机制，为神经再生治疗脑卒中提供新靶点。

脑卒中是危害人类健康的第三大疾病，其高致残率和致死率归因于神经元死亡导致的永久性神经功能缺陷。发现促进神经再生修复的新靶点和新方法，是目前脑卒中神经康复治疗的难点。本研究旨在体内外研究EphB4是否参与调节了神经干细胞的增殖、分化、凋亡活动，并探索其下游信号通路与调节机制，同时初步建立电刺激治疗手段，并明确其促神经再生康复治疗作用和可能机制。体外研究使用沉默慢病毒与过表达慢病毒转染细胞，分别下调和上调原代人胚胎神经干细胞EphB4基因水平及其蛋白表达水平。通过克隆分析、BrdU、Dcx、βⅢ-tubulin、GFAP、NG2免疫荧光染色观察EphB4对干细胞增殖、分化的影响；通过Cleaved-caspase3、caspase8免疫荧光染色，AnnexinⅤ-PE /7-AAD流式试剂盒分析EphB4对神经干细胞凋亡的影响；使用CyclinD1/CDK4抑制剂FAS，Abl抑制剂Gleevec，Abl激动剂DPH探索EphB4下游信号通路。进一步地，我们采用CRISPR/Cas9技术制备EPHB4 (flox)基因条件性敲除鼠，正在与Nestin-creERT2的小鼠杂交，以获得EPHB4(f/f);Nestin cre/+小鼠，对其进行他莫昔芬注射敲除nestin阳性细胞EPHB4的表达。为不影响研究任务，采用通讯评审的建议，使用携带shRNA的慢病毒载体脑室注射沉默EPHB4表达，在体观察EPHB4沉默对干细胞增殖分化的影响。我们在定点注射内皮素-1诱导运动皮层缺血的模型上，通过面条矩阵任务等评估电刺激治疗对前肢功能改善的效果。结果表明，EphB4基因沉默抑制体外培养以及大鼠脑缺血后SVZ区的干细胞增殖，抑制人胚胎神经干细胞神经元的分化，促进细胞向胶质细胞分化。而该基因过表达能促进神经干细胞的增殖及向神经元的分化，抑制细胞向胶质细胞分化。EphB4参与调节神经干细胞增殖，而且是决定神经干细胞向神经元分化还是向胶质细胞分化的开关，其很可能成为脑卒中后神经元修复的有效治疗靶点。同时发现在大鼠运动皮层缺血7天后，进行30Hz小脑外侧核电刺激14天，能显著改善面条矩阵任务面条抓取分布，增加面条抓取数量，减少大鼠Ladder rung walking 实验错误步数，缩小梗死体积，且这种改善与促进神经发生有密切关系，将为脑卒中等神经系统疾病临床康复治疗提供新的治疗方法。