疟原虫TatD-like DNase的功能分析及与虫体致病的相关性分析

免疫细胞（巨噬细胞、嗜中性粒细胞等）在病原生物感染的部位聚集和释放免疫相关因子（淋巴因子、蛋白质水解酶、DNA网等）是机体抵抗病原感染的先天性免疫反应。恶性疟原虫感染人体后，寄生的红细胞在后毛细血管区大量聚集，阻碍血液循环，造成组织功能障碍。然而，在虫体聚集的部位很少有免疫细胞浸润和明显的炎症反应。很明显，疟原虫具有拮抗宿主免疫系统的清除作用。疟原虫分泌的TatD-like DNase分子很可能是虫体拮抗宿主免疫清除作用的关键分子。本研究将对感染人的疟原虫的TatD-like DNase的功能进行系统研究，首先分析TatD-like DNase在各种疟原虫中的表达规律、对宿主DNA的降解作用和对感染宿主免疫细胞的激活或抑制作用。最后通过基因敲除的方法，以感染鼠的伯氏疟原虫为模型，比较基因敲除前后的虫体的致病力变化。进而确定该蛋白质的表达与虫体致病力之间的的关系和疟原虫的致病机理。

疟原虫对宿主的危害主要发生在血液期，即虫体在宿主红细胞内的发育繁殖过程。多年来对疟原虫的生物学及致病机理的解析一直存在着很多空白。本研究通过生物信息学分析首先预测发现疟原虫能降解宿主免疫细胞胞外陷阱ETs (Extracellular Traps)结构的TatD-like DNase。疟原虫的TatD-like DNAse是一种非金属依赖性的脱氧核糖核酸酶，其序列在不同疟原虫中非常保守，并且在N端存在一个20个氨基酸左右的信号肽。进一步对PfTatD在疟原虫红内期的转录表达分析表明，PfTatD在疟原虫红内期全程转录表达，并且在32小时达到转录高峰。间接免疫荧光和免疫电镜研究结果与生物信息学预测相符，该蛋白质存在于纳虫溶泡膜与染虫红细胞膜之间，并且具有向外分泌的趋势。在鼠疟原虫相关实验中，发现TatD的转录与表达和虫体的毒力成正相关，这也说明了该蛋白质在虫体致病中的作用。进一步采用double crossover的方法敲除了P.berghei ANKA株编码PbTatD的基因。对缺陷虫株的毒力分析结果显示，缺陷表达虫株的感染能力和致死性都明显下降。而将缺陷表达虫株与巨噬细胞J774A.1体外共培养，发现该虫株可以诱导巨噬细胞产生ETs结构，并且产生的数量明显高于野生型虫株。说明疟原虫TatD参与了虫体逃避宿主ETs清除的过程。而在酶活性实验中，重组TatD蛋白质能够降解宿主DNA，这也进一步验证了TatD参与虫体致病性逃避宿主清除机理的假说，即虫体将TatD蛋白质释放到胞外，通过其脱氧核糖核酸酶的活性降解宿主产生的ETs结构中的DNA骨架来逃避其杀伤性作用。通过对小鼠免疫重组PbTatD和PcTatD蛋白质评价该蛋白质的免疫保护性。结果显示免疫组的染虫率要低于空白组和阴性组，并且小鼠的存活时间更长。而血清治疗实验的结果也与免疫保护试验的结果相符。以上结果显示，该蛋白质作为一个虫体致病相关蛋白质，参与了虫体逃避宿主天然免疫的过程，并且具有作为红内期疫苗的候选抗原的潜力。本研究首次揭示了TatD-like DNase蛋白质作为疟原虫致病相关蛋白质，参与虫体逃避NETs清除的过程，这对深入理解疟原虫逃避宿主天然免疫具有重要的意义，也为研制疟疾疫苗提供了新的思路。