胶孢炭疽菌中Dolastane生物合成基因簇的激活及相关衍生物的靶向挖掘

Marine sources of varied plants and animals produce some of the most intricate and fascinating organic molecular structures known in nature. One such collection of molecules is the dolastane group of diterpenes. Previously reported dolastanes include dolatriol, which was originally isolated from the poisonous sea hare Dolabella auricularia, but is actually produced by brown algae and accumulates in the sea hare through its diet. Access to dolastanes is of high interest because several oxidized members of these class modulate the effects of other drugs in resistant Staphylococcus aureus strains. Our preliminary study has demonstrated a chemical investigation into the organic extracts from the heterogenous expression of CgDS gene from filamentous fungi Colletotrichum gloeosporioides ES026 led to the isolation of one diterpenes featuring the relatively rare dolastane skeleton isolated exclusively from marine sources. Current research is focusing on CYP450 genes- t15 from the same gene cluster. Because CYP450 dependent monooxygenase relies on eukaryotic systems, prokaryotes is typically unsuitable for the expression of eukaryotic P450 enzymes. In an effort to elucidate the biosynthesis of dolastane type diterpenoids, Saccharomyces cerevisiae is chosen as the chassis strains. The combination of genetic knockout, overexpression, heterologous reconstitution in S.cerevisiae, and in Vitro biochemical assays, leading to produce new dolastane types intermediates or analogues. There new compounds will be provided as chemical entities as putative anticancer agents. These results not only contribute to a better understanding of the dolastane type diterpenoids biosynthetic pathway, but also provide efficient methods to further improve the product yield and generate new dolastane type compounds.

Dolastane型化合物为具有抗癫痫、抗超级细菌、抗炎症等多种活性的海洋来源二萜产物，发现至今已有40余年，受限于其独特的产物结构及采集资源限制，生物合成机理长期悬而未决，无法通过生物合成获得该类产物。申请者前期在植物内生真菌胶孢炭疽菌ES026基因组中挖掘嵌合萜合酶CgDS，催化底物可生成两种具有dolastane骨架的化合物dolastadiene和araneosene。本项目拟以CgDS所在的生物合成基因簇为研究对象，利用生物信息学分析预测特殊功能基因，在表征外源启动子在ES026体内强度的帮助下，利用成熟的遗传转化操作系统，在出发菌株上对其进行阻断，强化表达及酿酒酵母异源表达方式相结合的手段，研究突变株代谢中间产物的积累，推测编码基因与产物之间的关系，为靶向挖掘含有dolastane结构单元的天然产物分子提供更多基因标记，对进一步对其进行遗传改造，得到结构新颖的类似物奠定基础。

Dolastane型化合物为具有多种活性的海洋来源二萜物，但由于其独特的产物结构及采集资源限制，无法通过生物合成获得该类产物。申请者前期在植物内生真菌胶孢炭疽菌ES026基因组中挖掘嵌合萜合酶CgDS，催化底物可生成具有dolastane骨架的化合物dolastadiene和araneosene。本项目以CgDS所在的生物合成基因簇为研究对象，利用生物信息学分析预测特殊功能基因，挖掘dolastane生物合成途径上的细胞色素P450氧化酶t15、氧化还原伴侣t7、脱氢酶t23等功能基因及其新骨架化合物。研究在酿酒酵母菌株上过表达MVA途径，成功构建了dolastane二萜化合物在S. cerevisiae上高效合成的优势底盘。并将这些关键酶基因整合至酵母基因组进行稳定表达，通过检测产物证明还原伴侣t7能够协助P450氧化酶t15在酵母体内完成催化功能，t23基因以dolastane化合物为底物时无催化活性。项目还在原始菌株中激活关键基因研究其功能。首先对不同来源的启动子在真菌体内启动基因表达的强度进行研究，根据启动子表征强度选取合适的启动子调控基因簇上关键酶基因表达强度，通过农杆菌介导的遗传转化方式转入。分析是由于MVA合成途径所需前体物质不够，发酵产物中并未检测到这些关键酶的活性。研究者又以E. coli菌株为宿主对t23进行体外异源表达与蛋白纯化，尝试不同蛋白表达条件后成功获得纯化蛋白，通过LC-MS检测蛋白反应产物证明t23蛋白能够催化丙酮酸合成乳酸，具有一定的羟基酸脱氢酶活性。因枯草芽孢杆菌分泌的真核来源的重组蛋白具有天然构象和生物活性等特点，我们尝试选取枯草芽孢杆菌为平台进行蛋白表达，通过菌株筛选成功获得一株自身系统蛋白表达效率高的枯草芽孢杆菌T5，以该菌株为平台，构建含t23基因的重组质粒，建立菌株T5的遗传操作系统，成功观察到该突变株中目标蛋白的表达。本课题靶向挖掘dolastane化合物生物合成途径上的关键功能基因t15、t7和t23，确定其催化活性并获得了dolastane类衍生物，同时尝试4种底盘菌株对dolastane化合物合成相关基因的表达效率，为dolastane生物合成途径的研究奠定了基础。