草莓胶孢炭疽菌效应因子的筛选及其致病功能研究

Strawberry anthracnose, caused by Colletotrichum gloeosporioides, is one of the most serious diseases of strawberry production worldwide. C. gloeosporioides can secret a large number of effector molecules that facilitate the infection of the host. At present, identification and functional studies of the effector is the key to the further study of fungal pathogenesis mechanism. As a hemibiotrophic fungus, the functional mechanism of effector genes in C. gloeosporioides from strawberry remains unclear. This project proposes to (i) screen the candidate effectors secreted at different stages (plant-penetrating appressoria, mature biotrophic hyphae and late necrotrophic phase) of C. gloeosporioides infection by transcriptome sequencing; (ii) take advantage of bioinformatics, subcellular localization, Potato virus X vector (PVX) expression system and transient expression system in Nicotian benthaminan to identify the effectors; (iii) construct gene deletion mutants and complement strains of the specific effector genes which overexpress at the infection stage; analyze the effect of specific effector genes deletion on various life activities of C. gloeosporioides based on a variety of phenotype tests such as pathogenicity. Characterization of these fungal effector genes will provide new insights into the molecular basis of the strawberry and C. gloeosporioides co-evolutitn. And this will also provide theoretical basis and technical support for the cultivation of new disease-resistant plants.

由草莓胶孢炭疽菌侵染引起的草莓炭疽病是我国乃至世界草莓生产上最重要的真菌病害之一。效应因子在真菌与植物互作中发挥着重要作用，其筛选和鉴定是目前研究的难点。作为半活体营养型真菌，效应因子在草莓胶孢炭疽菌活体营养和死体营养阶段中的作用机制尚不明确。本项目拟 (1) 通过转录组学方法对草莓胶孢炭疽菌不同侵染阶段 (入侵产生附着胞时期、活体营养时期以及晚期死体营养期) 分泌的效应因子进行筛选；(2) 采用生物信息学、亚细胞定位及抑制植物细胞免疫反应的方法对候选效应因子进行鉴定； (3) 对在侵染不同阶段中过表达的特异性效应因子基因进行基因敲除与回复，通过菌丝及分生孢子形态、生长速率、致病力等表型鉴定，分析其对草莓胶孢炭疽菌各项生命代谢活动的影响，阐明其在致病过程中的作用机机制。本研究可以为深入了解草莓和胶孢炭疽菌共进化的机制，培育广谱、持久抗病的新品种，提供理论基础和技术支持。

由草莓胶孢炭疽菌侵染引起的草莓炭疽病是我国乃至世界草莓生产上最重要的真菌病害之一。效应因子在真菌与植物互作中发挥着重要作用，其筛选和鉴定是目前研究的难点。本研究完成了草莓胶孢炭疽菌不同侵染阶的转录组学分析，对得到的数据进行了生物信息学分析，预测了胶孢炭疽菌候选效应因子，并对候选效应因子CgSlp1进行了功能鉴定，为揭示草莓和胶孢炭疽菌共进化的机制，培育广谱、持久抗病的新品种，提供理论基础和技术支持。主要结果如下：.1.胶孢炭疽菌侵染草莓叶片的转录组学分析.利用显微镜及组织病理学方法明确了草莓胶孢炭疽菌侵染草莓后的三个不同阶段：入侵产生附着胞时期（24 h）、活体营养时期（72 h）以及晚期死体营养期（96 h）；选取这三个时间点的草莓叶片样本进行转录组学测序，真菌差异表达基因总数为7811个，草莓差异表达基因总数为2273个。初步明确了胶孢炭疽菌的致病机制；..2.胶孢炭疽菌候选效应因子的预测.转录组学数据结合生物信息学分析，获得了胶孢炭疽菌侵染草莓叶片后的三个关键时期的候选效应因子85个；.3.7个候选效应蛋白的功能鉴定.将 7 个胶孢炭疽菌候选效应子编号为Cg1~Cg7，并进行烟草瞬时表达分析。结果显示， Cg1~Cg7在细胞核和细胞膜上均有分布；Cg1~Cg7均可抑制 Bax 引起的过敏性坏死反应。.4.特异性效应因子CgSlp1的突变及突变株的功能互补分析：获得了CgSlp1的缺失突变体及回复突变体各1个。致病力测定结果表明，当编码该效应因子的基因缺失时，胶孢炭疽菌对草莓叶片的致病力显著降低，说明效应因子CgSlp1在胶孢炭疽菌的致病过程中发挥着至关重要的作用。对效应因子CgSlp1的野生型菌株、突变菌株及互补菌株的生长速率进行了测定，突变菌株与野生型菌株和互补菌株相比，气生菌丝较为稀疏，生长速度慢，差异较大，在菌丝和孢子形态方面无显著差异，但突变菌株的孢子产量显著低于野生型菌株和互补菌株。