长链多不饱和脂肪酸激活血管平滑肌细胞大电导钙激活钾离子通道的分子机制

Omega-3 polyunsaturated fatty acids (n3-PUFAs) is not only the important nutrients but also has a significant blood pressure- depressing effect. The effect may be related to the activation of large-conductance and calcium-activated potassium channels (BK) in vascular smooth muscle cells. But the detailed mechanism is unclear. In the previous study, we have found that both DHA and EPA, two main forms of n3-PUFAs in human body,significantly activated BK channels in vascular smooth muscle cells from mice and we concluded there was a direct intercation between n3-PUFAs and BK channels. In the present study, we will further investigate the involved mechanism using in-vitro expression system. We will first observe the effect of DHA and EPA on the electrophysiological properties of cloned human BK channels. Then，we will analyze the biophysical mechanism by using HA model. In addition, we will locate the potential sites for DHA binding using molecular mutagenesis assisted by amino acid modification. Finally,we will construct the structure of full-length human BK channel based on the crystal structure of the homologue channels. By using molecular dynamics calculations and simulations, we will elucidate the detailed structural basis for BK channel activation by n3-PUFAs. The results will not only extend the current understanding of the mechanisms in the role of n3-PUFAs in the prevention and treatment of hypertention and other cardiovascular diseases but also will be valuable in guiding the drugs design targeting BK channel.

n3长链多不饱和脂肪酸(n3-PUFAs)是重要的营养物质且具有显著的降血压效应,其作用可能和血管平滑肌细胞大电导钙激活钾离子通道(BK)的激活有关,但详细机制尚不清楚。我们前期的结果显示:体内两种主要的n3-PUFAs(DHA和EPA)显著激活小鼠血管平滑肌细胞BK通道,且它们和BK通道可能存在直接作用。本研究将借助体外表达系统，进一步研究它们和通道作用的分子机制。我们拟首先应用膜片钳技术观察DHA对克隆的人BK通道电生理特征的影响,然后使用HA模型分析它们对通道作用的物理学机制；以分子突变为主结合氨基酸修饰探寻DHA和通道作用的潜在位点；并根据现有同源通道的晶体结构构建BK通道全长结构模型并应用分子动力学计算和模拟来揭示n3-PUFAs激活BK通道的结构基础。本研究结果将深化对n3-PUFAs的抗高血压和其它心血管疾病防治作用机制的认知,对以BK通道为靶点的药物设计具有重要的指导意义。

BK通道是一种受电压和胞内钙离子双重激活的钾离子通道，在人体内分布广泛，通道功能异常可导致癫痫，高血压，糖尿病等多种疾病。我们采用离体膜片钳记录方法，发现DHA在不同电压和Ca2+浓度下显著增加小鼠主动脉血管平滑肌细胞单通道电流幅度、平均开放概率(Po)、平均开放时间等电生理学参数。进一步的实验显示beta1、beta4而非beta2以及gama亚基对DHA激活BK通道具有显著放大效应。而这一作用的重要结构基础是位于beta1/4亚基细胞内N-端一个局部结构域。在体实验显示，DHA对野生型小鼠和BK通道基因缺失小鼠的降血压效应明显不同， DHA可以显著下降小鼠血压达15mmHg。 相反，在BK通道基因缺失型小鼠，DHA对血压几乎没有任何影响。提示DHA可以特异性增强血管平滑肌BK通道的电流，通过BK通道，DHA发挥了其降血压效应。. 为了寻找潜在的作用位点，我们以hSlo1羧基端晶体结构(3MT5)和哺乳动物Kv1.2的跨膜结构(2A79)为基础, 应用SWISS-MODEL和PyMOL构建完整的hSlo1结构。利用这一结构，我们推测一个由碱性氨基酸构成的口袋状结构可能和DHA的羧基具有结合作用，但我们的研究显示对这些氨基酸突变并未改变DHA的激活效应。. 通过BLI体外结合实验，我们观察了体外表达纯化的BK通道蛋白和DHA的结合，发现二者具有直接的相互作用。这一研究结果直接证明了DHA是BK通道的配体。为了进一步探索这种技术是否适用于其它脂质成分和其它种类的离子通道蛋白， 我们研究了PIP2 等细胞膜重要信号分子对EAG1 通道的作用，研究发现PIP2 可以剂量依赖性的增加EAG通道蛋白的BLI结合信号。通过对比PIP2 和EAG1通道蛋白的电生理学研究结果，发现使用该技术得到的蛋白和脂质的亲和力常数和电生理记录所得到的结果很相似。从而为研究离子通道蛋白和小分子的结合提供了一种高通量的检测方法。我们的结果不仅对理解多不饱和脂肪酸的保护作用机制提供了依据，并且为以离子通道为靶点的药物发现具有一定的指导意义。