乙醇发酵条件下的菊粉酶表达机制及调控

菊芋具有耐盐耐旱等抗逆性能，可在不适宜于粮食和经济作物生长的非耕地种植，是燃料乙醇生产可供选择的粮食替代资源之一。克鲁维酵母能够分泌菊粉酶，同时糖化发酵菊芋为乙醇，是实现菊芋生物炼制的最好选择。但发酵过程中出现菊粉酶分泌受到抑制的现象，制约了其工业化进程。本课题针对菊芋乙醇发酵过程中出现的"菊粉酶酶活低，水解速率慢"问题，利用酶学分析、HPLC/LC-MS等手段监测细胞内外的代谢物、核苷酸, 利用数字表达谱检测相关代谢途径基因转录水平的变化，解析菊粉酶分泌机制，阐明该酶的诱导及阻遏机理；针对发现的关键基因，结合基因敲除、基因过表达等手段进行改造，使得产酶、糖化和乙醇发酵速率匹配，提高乙醇发酵效率。该研究有助于深入理解菊粉酶的表达机制，为微生物细胞工厂代谢菊芋积累其他初级代谢产物（如柠檬酸、乳酸、甘露醇等）提供指导，并对开发纤维素类生物质的一步法乙醇（CBP）发酵策略具有重要参考价值。

CBP发酵是集菊粉酶分泌、糖化、乙醇发酵于一体的技术。其中菊粉酶活力是最关键因素之一。本课题首先考察了不同碳源，碳源浓度对菊粉酶活性的影响，发现菊粉对菊粉酶的产生具有一定的诱导作用，而葡萄糖和果糖对产酶过程有一定程度的抑制作用。通气量对酶活性的影响也很重要。外加15%乙醇对菊粉酶活力没有影响。对菊粉酶启动子序列进行了结构分析，发现存在5个潜在的底物结合位点。比较了不同长度的INU启动子启动活性的差异，进一步确定了其核心启动区域。采用易错PCR进行随机突变，筛选到具有高启动活性的启动子，为菊粉酶在高底物浓度下活性的提高奠定了基础，同时为其他类似酶的表达机制如纤维素酶提供了重要的参考。.建立了CBP乙醇发酵的方法，研究了通气量对乙醇生产的影响。研究结果表明通气量是影响整个发酵过程最关键的因素，在一定的通气量条件下，发酵终点时间缩短、残糖浓度降低，但是相应的乙醇得率依据特定通气量有所降低。为精确控制通气量，我们利用氧化还原电极控制氧化还原电位来表征发酵系统中的溶氧。氧化还原电位控制在 -130 mV时的发酵结果最为理想，解决了乙醇得率与发酵时间及残糖浓度之间的矛盾。并且证明了不通气条件下发酵终点残糖浓度过高的主要原因与细胞活性低密切相关。综合胞外代谢物的数据，建立了不同条件下的碳流分布，明确了糖代谢途径的差异。.应用RNA-Seq技术探讨了K. marxianus在不同发酵条件下，如高糖与低糖、厌氧和好氧情况下关键基因的表达差异。基因组注释工作结果共整合8条染色体，GO和KEGG数据库分别注释了8435和1882个基因。差异基因的分析涉及中心碳代谢途径、乙醇生成以及甘油、乙酸等副产物代谢途径、氧化压力防御途径、糖转运蛋白、转录调控相关基因和细胞自噬和线粒体氧化磷酸化相关基因。确定了导致发酵性能不同的可能候选关键基因。通过敲除和过表达特定基因，解除了菊粉酶的底物调控，使得产酶、糖化和乙醇发酵速率匹配，提高了K. marxianus乙醇发酵效率。