猪繁殖和呼吸综合征病毒诱导IL-10产生的分子基础研究

Porcine reproductive and respiratory syndrome(PRRS) can negatively modulate the host immune system. Many research inducted that PRRSV infection enhances systemic interleukin-10 production in infected pigs, it notion that IL-10 as a immunoregulator may involved in the impairment of the immune system during PRRSV infection.Our present study suggested that the different expression IL-10 level during PRRSV HuN4-F5 and HuN4-F112 infection.In this study we focus on the expression level of IL-10 during PRRSV infection,base on the reverse genetic systems of highly pathogenic porcine reproductive and respiratory virus HuN4-F5 strain and its attenuated vaccine strain HuN4-F112, full length infectious cDNA clones with interchange structure or non-structure protein coding regions will be generated and chimera viruses will be rescued. After the rescued viruses were infected PAM/PBMC cell, the IL-10 mRNA and protein levels were tested use ELISA, flow cytometry and Real-time PCR. Explain the influence of JAK/STAT system on PAM during PRRSV infection, check the porcine alveolar macropage and PBMC cell differentiation. Infect pig with chimera virus to check the expression of IL-10 and the regulation of immune system. Use the infection clone of HuN4-F5 and HuN4-F112 to check the universal function of conding regions.Our result will provide valuable date for explaining the mechanism of immune evasion of PRRSV.

猪繁殖和呼吸综合征病毒(PRRSV)感染后能够调节机体免疫应答，研究显示这种调节与机体IL-10表达水平密切相关。实验室前期研究证实HuN4强/弱毒感染后，体内IL-10表达水平有显著差异。本项目以IL-10表达差异为切入点，借助PRRSV HuN4株强/弱毒感染性克隆平台，对病毒功能基因进行互换，获得一系列强弱毒嵌合突变体感染性克隆株，感染PAM/PBMC细胞，检测IL-10基因和蛋白表达水平。在PAM细胞上研究嵌合病毒对JAK/STAT系统的影响，检测PAM细胞的分化情况以及PBMC中分泌IL-10细胞亚群的变化情况。在猪体内验证功能基因对IL-10表达水平的影响以及对机体免疫应答的调节。选取异源毒株，在HuN4强弱毒感染性克隆基础上验证试验结果的普遍性。从基因、蛋白、细胞以及机体免疫水平多层次阐述PRRSV感染引发IL-10表达上调的机制，为阐述PRRSV免疫逃避的机制提供有益参考。

猪繁殖与呼吸综合征是由猪繁殖与呼吸综合征病毒引起的，以仔猪呼吸困难和母猪繁殖障碍为主要特征的一种传染病。作为重要的免疫抑制因子与抗炎因子，IL-10在病毒介导的免疫抑制中起重要作用。多个研究结果显示PRRSV感染引起的对免疫系统的抑制与IL-10的表达水平密切相关。实验室前期研究显示：HuN4强毒株及其传代致弱病毒HuN4-F112体内感染猪只后，HuN4株能够诱发高水平的IL-10表达，而HuN4-F112感染后IL-10表达水平则很低。为研究PRRSV强弱毒感染后诱导IL-10产生的分子基础，我们首先对PRRSV HuN4株强弱毒体外感染外PAM细胞诱导IL-10产生水平进行研究。实验结果显示：PRRSV HuN4强弱毒感染PAM细胞后，诱导IL-10转录和表达水平存在明显差异，强毒显著高于弱毒，强毒感染后能够显著诱导IL-10通路中TLR2、TLR4、TRIF表达水平上调和P38磷酸化水平上调。强弱毒感染PAM诱导IL-10表达水平的差异可能是由于强毒通过MAPK途径中P38磷酸化水平上调造成的。为了探寻PRRSV基因组上对IL-10表达具有调控作用的区域，我们在PRRSV HuN4株强弱毒反向遗传操作系统上对引起强弱毒诱导IL-10产生差异的病毒编码区进行探寻，实验结果显示：PRRSV ORF1a编码区以及结构蛋白编码区能够显著影响病毒感染PAM细胞后的IL-10产生水平，其中NSP2编码区起主要作用。将NSP2互换的嵌合病毒感染猪只，在体内验证NSP2编码区诱导机体产生IL-10的影响，结果显示：将强毒NSP2编码区替换为弱毒后，嵌合病毒诱导IL-10产生水平显著低于亲本强毒；将弱毒NSP2编码区替换为强毒后，嵌合病毒诱导IL-10水平显著高于亲本弱毒。同时NSP2编码区互换后能够显著影响嵌合病毒在猪体内的复制水平以及对猪只的致病力，强毒NSP2编码区替换为弱毒后嵌合病毒在体内复制水平及致病性显著低于亲本强毒，弱毒NSP2编码区替换为强毒后嵌合病毒在体内复制水平及致病性显著低于亲本弱毒。体内试验结果证实：NSP2编码区能够显著影响PRRSV体内复制水平、IL-10产生水平以及病毒致死性毒力。