绿脓杆菌新型集成群体感应系统的功能及机理研究

Quorum sensing (QS) is a widely conserved cell-to-cell communication mechanism which coordinates various bacterial community activities including virulence gene expression and biofilm formation. It is of vital importance to study bacterial quorum sensing mechanisms for design and developing new strategies to control and prevent bacterial infections. Pseudomonas aeruginosa employs a hierarchical quorum sensing (QS) network consisting of las, pqs and rhl regulatory elements to coordinate expression of bacterial virulence genes. However, clinical isolates frequently contain loss-of-function mutations in the central las system. This motivated us to search for a mechanism that may functionally substitute las, which led to identification of a novel QS signal IQS. Disruption of IQS biosynthesis paralyses the pqs and rhl QS systems and attenuates bacterial virulence. Production of IQS is tightly controlled by las under normal culture conditions but is also activated by phosphate limitation, a common stress bacteria encountered during infections. Our findings unveiled a novel integrated QS system which connects the central las system and phosphate-stress response mechanism to the down-stream pqs and rhl regulatory systems. In this project, we aim to investigate the signaling pathway and regulatory mechanisms of IQS. We will determine the IQS receptor protein and down-stream regulators. In addition, we will also analyze the synthetic pathway and transportation mechanism of IQS.

群体感应是微生物中广泛保守存在的一种细胞与细胞间的通信机制，协调细菌各种群体活动，研究群体感应机制对控制和预防细菌感染至关重要。绿脓杆菌采用由las、pqs及rhl调控系统组成的群体感应网络协调其毒力基因表达。但不少临床分离株均发现中央Las系统功能突变受损，促使我们探索绿脓杆菌是否存在一种可能取代las的机制，并最近分离鉴定到一种新群体感应信号IQS。阻断 IQS合成导致pqs及rhl系统的群体感应并显著降低菌株毒力。IQS产生受las严格控制但同时也被磷酸贫乏状况激活，磷酸贫乏是细菌感染过程中的常见胁迫信号。我们的研究结果首次证明绿脓杆菌存在一种新型集成群体感应系统，上连中央las系统和磷酸胁迫应激反应机制，下接pqs及rhl系统。本项目旨在研究IQS受体蛋白和下游调控因子，分析IQS合成途径和分子运输机理，明确IQS信号通路和调节机制，为阐明绿脓杆菌群体感应机理和致病调控机制奠定基础

绿脓杆菌是医院感染最常见的病原菌之一，对绝大部分抗生素均表现极强的抗药性，临床治疗困难很大。我们几年前首次报道了绿脓杆菌的一个全新的群体感应集成系统IQS，该系统连接中央 las系统和磷酸应激响应机制和下游的pqs和rhl系统，病原细菌因而既能感应细菌群体的变化也能感受寄主体内磷酸枯竭逆境状态，进而调控一系列细菌毒力基因的表达。本项目旨在系统研究IQS系统的信号转导通路和通讯机理。研究结果表明低磷逆境诱导pvdQ 基因的表达，其产物降解 las 群体感应信号N-酰基高丝氨酸内酯。PhoB可以结合pvdQ的启动子区域、从而正向调控pvdQ的转录表达。敲除pvdQ后，绿脓杆菌IQS和PQS群体感应信号合成显著降低、致病因子的产生和致病毒力明显下降，说明PvdQ在IQS信号调控过程中起重要作用。我们进而构建了依赖于IQS信号的报告菌株，对其突变体进行筛选分析发现了调控基因iqs32。其表达在缺铁和缺磷情况下受IQS的正向调控;iqs32在IQS合成缺失突变体ΔambB中表达明显降低，但添加外源IQS可以恢复其表达。Iqs32对致病因子的产生不可或缺,添加外源IQS可以恢复突变体ΔambB中致病因子的产生，但无法恢复突变体Δiqs32的表型。说明IQS信号通过调控Iqs32的表达，进一步影响致病因子的产生。在分析IQS信号调节子的过程中，我们注意到一个编码化学代谢产物（称之为IQS2）的基因簇在IQS合成突变体ΔambB明显下调。IQS2终端合成基因的删除对IQS和3OC12HSL的产生没有影响，但导致QS信号PQS和C4-HSL水平以及致病因子产生的降低，这表明它位于IQS信号的下游。另外，表型分析结果表明两相调控系统IqsSR调控与IQS和IQS2相同的表型，等温滴定量热法研究发现IqsS和IQS2有蛋白-信号相互反应，证明IqsS与IQSII的信号转导有关。我们的实验结果还表明IQS与IQS2有一定的结构相似性，分别由同一基因簇的不同基因编码产生。综上所述，本项目的实验结果进一步阐明了IQS通讯系统的功能与调控机理，丰富了我们对绿脓杆菌复杂而多元的群体感应通讯网络的认识，并为发展新型病害防控策略提供了分子基础和新的思路。