海南粗榧悬浮细胞合成抗癌三尖杉酯类碱的调控研究

立项意义：海南粗榧已被国家列为二级珍稀濒危保护植物，在所有三尖杉植物中，它的三尖杉酯碱与高三尖酯碱含量最高，是它们的主要药源植物。三尖杉酯碱与高三尖杉酯碱已临床化与商品化，有很好的抗癌效果，迫切需要新的技术来解决它们的基源植物资源瓶颈问题，植物细胞悬浮培养是解决该问题的重要技术手段。海南粗榧悬浮培养细胞合成三尖杉酯类碱的技术还未成熟，急待研究开发。.本项目研究内容：① 海南粗榧细胞悬浮培养体系的建立与悬浮培养条件的优化；② 海南粗榧内生真菌的分离；③诱导与促进海南粗榧悬浮细胞合成三尖杉酯类碱的研究。研究重点是②与③点。本项目特色在于研究对象属热带特有的珍稀植物。研究目标是建立海南粗榧悬浮细胞培养体系，探索海南粗榧悬浮细合成三尖杉酯类碱的调控机理。创新点：①利用海南粗榧悬浮细胞合成抗癌三尖杉酯类碱；②利用内生真菌培养液作为诱导海南粗榧悬浮细胞合成三尖杉酯类碱的指向性诱导子。

海南粗榧（Cephalotaxus mannii）属国家二级保护植物，是抗癌药物三尖杉酯类碱的重要药源植物。但海南粗榧繁殖速度慢，且难以人工栽培。采用植物细胞悬浮培养技术是解决三尖杉酯类碱基源植物资源瓶颈问题的重要技术手段。本项目主要研究内容：① 海南粗榧细胞悬浮培养体系的建立；② 海南粗榧内生真菌的分离及在细胞悬浮培养中的应用；③ 诱导及促进海南粗榧悬浮细胞合成三尖杉酯类碱的研究。. 以海南粗榧嫩叶为外植体，采用升汞与臭氧相结合的办法消毒，在培养基MS上诱导可获得松散的愈伤组织。以MS为培养基进行海南粗榧细胞悬浮培养。其三尖杉酯碱合成能力为0.1 mg/g (干细胞)，体积生产力为1～3 mg/L。在悬浮细胞培养物中，添加诱导子茉莉酸甲酯（MJ）、水杨酸（SA）与内生真菌诱导子。发现内生真菌诱导子能提高磷酸戊糖途径（HMP）关键酶6-磷酸葡萄糖脱氢酶（G6PDH）活性，而MJ与SA对G6PDH没影响。MJ、SA与内生真菌诱导子的最适使用量为100μmol/L，50 μmol/L与40 mg/L，其产物产量分别是对照的3.4、2.26与2.02倍。NaF与L-环己丙氨酸都是糖酵解途径（EMP）抑制剂。NaF能提高G6PDH的活性，使HMP途径得到加强。当培养物添加NaF最适量15mg/L时，其产物含量是对照的3.7倍。NaF与MJ对产物合成有很好协同效果，当NaF与MJ同时加入到培养液中时，其产物产量要比单独添加NaF或MJ要高出80%左右。L-环己丙氨酸能提高G6PDH活性。但L-环己丙氨酸对产物合成的促进作用比NaF强，当添加L-环己丙氨酸最适用量0.1mmol/L时，其产物产量是NaF的1.38倍。综上结果，抑制EMP途径，而强化HMP途径有利于产物合成。抑制三尖杉酯类碱合成支路--色氨酸合成途径，对三尖杉酯类碱合成有促进作用。5-甲基-DL-色氨酸是色氨酸合成途径反馈抑制剂，添加5mg/L，可使产物提高2.2倍左右。通过这些研究，产物含量可达7～9 mg/L，是对照的2～4倍。. 本项目的科学意义：在建立海南粗榧细胞悬浮培养的基础上，确定了诱导子对三尖杉酯类碱合成的促进作用。揭示了糖的两个代谢途径即EMP与HMP途径对三尖杉酯碱合成的影响。强化HMP途径有利于产物三尖杉酯类碱的合成。抑制产物合成代谢支路色氨酸合成途径也可提高产物的合成。