基于对NLRP3炎症小体的调控探讨土茯苓抑制肝纤维化的分子机制及作用靶点

Hepatic fibrosis is a common pathological reaction caused by liver cell necrosis or inflammation, which has a high incidence whether in human beings or animals, and it carries a poor prognosis. Researches have shown that some traditional Chinese medicine and Chinese herbal medicinal ingredients have effects of inhibiting the production of fiber and improving the degradation of fiber and so on. Our previous studies have shown that Rhizoma smilacis glabrae (RSG) has a strong protective effect on LPS induced damage of the rat normal liver cell (BRL), and its mechanisms relate to TLR4, NF-κB, and IRF3 signaling pathway. Additionally, RSG could protect rats with CCL4-induced hepatic fibrosis and significantly decrease expression of NLRP3、ASC, and caspase-1 which relate with NLRP3 inflammasome, but therapeutic targets of the RSG are still rather vague. Therefore, in this study, rat hepatic stellate cells (HSC) would be used as the research object, and after knocking down NLRP3, ASC or Caspase-1 of HSC, RSG water-extract and its main constituent Astilbin would be used to intervene HSC. Through investigation of the degree of proliferation and activation of HSC, Bax, Bcl-2 and collagen synthesis, NLRP3, ASC and caspase-1 expression, IL-1β and IL-18 mRNA expression, et al., the molecular target of RSG treating hepatic fibrosis would be clarified on cellular molecular and gene level and the effect of its effective anti-inflammatory constituent Astilbin on hepatic fibrosis would be reassessed, which build the foundation for RSG using in the clinical treatment of hepatic fibrosis in the future.

肝纤维化在人和动物临床均具有较高发病率，而且往往预后不良。研究表明，一些中药及中药成分具有抑制纤维产生、提高纤维降解等作用。课题组前期研究显示，中药土茯苓可以通过影响TLR4信号通路、阻碍NF-κB和IRF3通路激活等途径保护LPS诱导的大鼠肝细胞损伤；土茯苓还可有效保护CCL4诱导的大鼠肝纤维化，显著降低肝脏炎症小体相关蛋白NLRP3、ASC和Caspase-1的表达，但作用靶点尚未明确。为此，本研究拟以大鼠肝星状细胞（HSC）为研究对象，分别敲低NLRP3、ASC、caspase-1 3个基因，用土茯苓及其抗炎成分落新妇苷进行干预，通过考察HSC的活化程度，Bax和Bcl-2胶原合成情况，NLRP3、ASC和caspase-1蛋白表达量，IL-1β和IL-18 mRNA表达等指标，从细胞和基因层面阐述土茯苓防治肝纤维化的分子调控机制及其相关作用靶点，为土茯苓用于肝纤维化的治疗奠定基础。

肝纤维化是由各种慢性肝病引发的一种可逆的病理过程，在人和动物都具有很高的发生率。目前已有的抗纤维化药物具有明显的副作用、毒性及耐药性。因此，临床上迫切需要开发高效、低毒的新型抗纤维化药物。中药因其成分复杂而具有多靶点、多活性、副作用少等优势，在对抗肝纤维化方面具有巨大潜力。土茯苓是一种药食同源的中药材，具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤、保肝等多种药理作用，但在抗肝纤维化方面未见报道。本研究通过体内外试验，对土茯苓水提液的抗肝纤维化作用进行了以下几个方面研究：（1）测定土茯苓水提液中活性成分。（2）体外研究土茯苓及其主要活性成分落新妇苷对HSC-T6的抑制作用，并利用siRNA干扰技术，敲低HSC-T6细胞中的与炎症小体相关的基因（NLRP3、ASC和Caspase 1)，探讨土茯苓水提液的可能的作用靶点。（3）采用四氯化碳（CCl4）诱导大鼠急性肝损伤模型，用土茯苓水提液干预治疗，探讨其对急性肝损伤的治疗作用。（4）采用四氯化碳（CCl4）诱导大鼠肝纤维化模型，用土茯苓干预治疗，探讨其对肝纤维化的治疗作用。结果表明，（1）CCK检测发现，土茯苓水提液能有效抑制HSC-T6细胞的增殖和活化。（2）在安全剂量范围内，落新妇苷对HSC-T6细胞的抑制作用不明显。（3）土茯苓水提液能显著抑制TGF-β1刺激的HSC-T6细胞中α-SMA和collagen Ⅰ基因表达上调。（4）沉默Caspase1基因后，α-SMA和collagen Ⅰ mRNA的表达显著降低，此时土茯苓水提液对α-SMA和collagen Ⅰ 基因表达的抑制作用不明显。说明Casp1对HSC-T6细胞的激活起到了关键作用，是肝纤维化发生的重要调控基因，也是土茯苓抗肝纤维化的重要靶点基因。（5）土茯苓水提液能有效保护CCl4诱导的大鼠急性肝损伤，其机制与调控NF-κB和Keap1-Nrf2-ARE信号通路、抑制NLRP3炎症小体的表达相关。（6）土茯苓水提液可以有效减轻CCl4诱导的肝纤维化大鼠的肝脏病理损伤和胶原沉积，增强机体抗氧化能力，其机制与调节Hippo/YAP信号通路转导有关。结论：（1）土茯苓水提液有显著的抗肝纤维化作用，可开发成人和动物肝纤维化的临床治疗药物。（2）Caspase 1基因是土茯苓发挥抗肝纤维化作用的有效靶点。（3）落新妇苷不是土茯苓抗肝纤维化的主要活性成分。