急性移植物抗宿主病状态下骨髓微环境对造血干/祖细胞功能影响及其机制

急性移植物抗宿主病（GVHD）导致的造血功能障碍严重影响移植患者的生存；骨髓微环境（niche）尤其是血管niche对造血干细胞/祖细胞（HSC/HPC）功能调控障碍可能为其发生的重要机制之一。为此，本项目以急性GVHD小鼠模型为平台，通过采用连续骨髓移植等干细胞生物学研究手段，观察急性GVHD状态下骨髓niche对HSC/HPC生物学特性的影响；分选急性GVHD小鼠骨髓血管niche中微血管内皮细胞，通过检测其表达HSC/HPC调控相关因子水平和体外培养体系中其对HSC/HPC增殖、凋亡、自我更新等能力的影响，以及体内实验中血管niche对HSC归巢、植入等能力的影响，明确急性GVHD状态下骨髓血管niche的功能缺陷，以及这些缺陷对HSC/HPC功能的影响和在急性GVHD导致造血功能障碍中的重要作用及机制，为临床预防和治疗急性GVHD所致造血功能障碍建立新方法提供新的思路。

急性移植物抗宿主病（aGVHD）是影响异基因造血干细胞移植（ASCT）成功最常见的并发症，重度GVHD往往合并造血功能障碍；而其导致造血功能障碍的机制目前仍不清楚。本课题拟明确aGVHD是否导致骨髓血管niche功能缺陷，并由此导致造血功能障碍及其机制。采用MHC单倍体相合小鼠移植成功建立aGVHD模型。为评价GVHD导致的造血功能障碍是由于HSC本身功能缺陷还是骨髓niche缺陷所致，采用连续移植（二次移植）和竞争性移植实验发现对照组和GVHD组小鼠骨髓细胞造血重建能力无差别；将正常供体小鼠骨髓细胞植入首次移植后对照组和GVHD组受体小鼠，结果GVHD小鼠体内再移植供体细胞数量及供体来源B细胞和单核细胞显著低于对照组。以上结果证明急性GVHD作用靶点为骨髓niche而非HSC/HPC。采用流式和病理组织化学等对GVHD组和对照组小鼠骨髓窦内皮细胞（SEC）进行研究观察GVHD对血管niche的影响。移植后GVHD小鼠骨髓SEC细胞数量显著低于对照组，免疫组织化学染色并进一步证实；GVHD状态下骨髓SEC凋亡增加，而增殖活性无明显变化，说明SEC减少为凋亡增加所致。CXCR4/SDF-1和SCF/c-kit轴为niche对HSC调控重要通路，通过检测HSC和VEGFR3+内皮细胞相关因子表达，证明GVHD对造血niche及造血的影响不是通过SDF-1/CXCR4通路，而是SCF/c-Kit通路。骨髓niche和血清中VEGF表达水平在GVHD小鼠显著低于对照组，同样说明GVHD状态下niche细胞功能缺陷。采用流式细胞术检测CD4+和CD8+细胞比例，结果显示移植后GVHD小鼠骨髓中CD4+细胞比例显著高于对照组，而CD8+细胞比例无明显差别；移植后GVHD小鼠骨髓SEC细胞MHC-II分子表达水平显著高于对照组，而MHC-I表达无差别，说明GVHD小鼠血管niche破坏由CD4+而非CD8+细胞所介导。移植后GVHD小鼠骨髓SEC细胞中Fas+细胞比例显著高于对照组，FAS基因表达水平显著也高于对照组；而且GVHD小鼠CD4+细胞FasL表达显著高于对照组，而CD8+细胞表达水平仅略高于对照组。以上结果表明GVHD小鼠骨髓niche中SEC损伤由供体CD4+T细胞所介导，并可能通过Fas/FasL途径诱导其凋亡。