土壤中双酚A的胶体金层析测定方法建立与评价研究

近年来世界各地土壤、尤其是污泥和水体中都有发现环境激素双酚A（Bisphenol A,BPA）残留。国内外未见土壤中双酚A单链抗体制备和胶体金层析方法的报道。本项目先合成鉴定双酚A人工抗原，取免疫小鼠脾细胞并提取纯化脾细胞中的mRNA后，用通用特定引物扩增抗体的VH和VL基因，拼接后克隆表达，免疫亲合法筛选产特异性抗体的重组噬菌体，在大肠杆菌里大量制备抗双酚A的单链抗体并进行纯化。然后探索胶体金制备、双酚A单链抗体金标记和纯化等方面的影响因素，建立土壤中双酚A的胶体金层析方法，确定线性方程、相关系数和测定范围，并进行方法的重复性、交叉反应和回收率等测定。该方法以抗原抗体反应为基础，具有操作简便，测定准确，可以用于广泛农村对土壤和农产品中双酚A残留快速检测的需要，对于防止双酚A不安全事件发生，研究与开发其它土壤环境激素的胶体金层析方法和提高我国土壤生物学研究及保障食品安全具有重要意义。

双酚A是一种环境内分泌干扰物，近年来发现世界各地土壤，尤其是污泥和水体中都含有双酚A，土壤中的双酚A会通过土壤-作物-食物进入体内，对人体造成危害。本项目旨在通过制备双酚A单克隆抗体，建立胶体金层析测定方法对土壤中双酚A进行快速检测。在成功制备抗原的基础上，取免疫小鼠的脾细胞与体外培养的骨髓瘤细胞融合，经过筛选和纯化得到单克隆抗体，并进行免疫分析方法研究。采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金，标记双酚A单克隆抗体，依据免疫层析技术研制检测双酚A残留的免疫层析快速检测试纸条(gold-based immunochromatographic assay, GICA)，检出限为100ng/mL,检测时间为10-15min. 并建立间接竞争酶联免疫吸附测定方法(indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay method, ic-ELISA)，对西洋菜土壤和水体中双酚A残留进行检测，最低检测限为0.5 ng/mL，IC50值为14.5 ng/mL，线性范围为1.3 ng/mL -292.2 ng/mL，相关系数为99%，样品加标回收率为86.7%-109.2%。与此同时，成功合成Cd掺杂ZnO水溶性量子点，并标记双酚A抗体，建立间接荧光免疫吸附测定方法(competitive fluorescence immunoassay, cFLISA)，最低检测限为13.12 ng/mL，IC50值为81.45 ng/mL，线性范围为20.8 ng/mL-330.3 ng/mL，加样回收率为85.92%-113.50%。这些研究可以用于广泛农村对土壤和农产品中双酚A残留快速检测的需要，对于防止双酚A不安全事件发生、研究与开发其它土壤环境激素的胶体金层析方法和提高土壤生物学研究及保障食品安全具有重要意义。