中华鳖（Pelodiscus sinensis）酪氨酸酶的生化特性及核心作用蛋白研究

Tyrosinase (E.C.1.14.18.1) is an important biomarker for immunity in lower aquatic animals. But the character and function of tyrosinase in Chinese soft-shelled turtle (Pelodiscus sinensis) have not been well reported. To elucidate the immunity influence and interaction mechanisms of tyrosinase in Chinese soft-shelled turtle, we conduct: (1) characterization biochemical properties of tyrosinase both in skin and in carapace; (2) effect of temperature on the gene expression and folding of tyrosinase during different developmental phases; (3) effect of ammonia on the tyrosinase catalysis and structure, as well as detoxification reaction of tyrosinase; (4) prediction of tyrosinase protein-protein interactions by using interactomics algorithms; (5) detection of binding hub proteins for tyrosinase by conducting yeast two-hybridization and proteomic analysis. To achieve these goals, tyrosinase purification, enzyme kinetics, thermodynamics, real time PCR, bioinformatic PPI mappings, molecular dynamics simulations, yeast two-hybridization, and proteomic 1D-LC/MSMS analysis are mainly conducted. As a result of this research, we can provide theoretical foundations aimed at manual control technique for immunologic function of Chinese soft-shelled turtle.

酪氨酸酶（EC 1.14.18.1）作为低等水生动物的免疫标志物已得到广泛认可,但目前对中华鳖(Pelodiscus sinensis)中酪氨酸酶的相关特性、功能及分子作用机制的研究还未见报道。为了探索酪氨酸酶对中华鳖机体免疫功能的影响及作用机制，本项目拟开展以下研究：（1）鉴定中华鳖皮肤和甲壳中酪氨酸酶的生化特性；（2）不同发育阶段温度对中华鳖酪氨酸酶基因表达和折叠的影响；（3）氨对酪氨酸酶催化作用和结构的影响及该酶的解毒作用；（4）计算机相互作用图谱预测与酪氨酸酶作用的核心蛋白质；（5）结合酵母双杂交和1D-LC/MSMS验证相互作用的核心蛋白质。为完成上述研究内容，开展酪氨酸酶纯化、酶动力学、热力学、实时PCR、蛋白质相互作用组学、分子动力学模拟、酵母双杂交、1D-LC/MSMS等实验，旨在为中华鳖免疫功能的人工控制技术研究提供理论依据。

酪氨酸酶（EC 1.14.18.1）是一种广泛存在于各种机体中的多功能酶，但目前对中华鳖(Pelodiscus sinensis)酪氨酸酶的相关特性、功能及分子作用机制的研究还未见报道。通过本项目的实施，我们在组织学水平、分子生物学水平、酶学水平、生物信息学水平和基因组水平研究了中华鳖酪氨酸酶的组织表达规律、酶动力学以及核心作用蛋白的筛选。项目主要内容如下：（1）建立了中华鳖体内酪氨酸酶的提取及测定方法；（2）克隆了中华鳖日本群体和乌鳖的酪氨酸酶基因及其表达情况；（3）通过多巴染色的方法研究了中华鳖体内酪氨酸酶的组织表达规律，发现在体内广泛表达；（4）利用生物信息学方法模拟了酪氨酸酶的高级结构，对氨酸酶抑制动力学进行了研究及计算机模拟，使用PEIMAP算法筛选了108个存在交互作用的蛋白质，用PPI作图模拟新发现了10个交互蛋白；（5）建立了中华鳖转录组数据库以及酵母双杂交文库，为进一步验证和发掘酪氨酸酶的功能奠定了基础。我们的研究对进一步探索中华鳖酪氨酸酶的生化特性和作用的分子机制，特别是对于中华鳖新品种——乌鳖黑色素沉积机制具有重要意义。