一个冷刺激结实相关秀珍菇MADS-box基因的克隆及功能分析

Cold stimuli (or cold stress) can has long been known to be necessary for fruit body formation in some species of basidiomycetes. Pleurotus pulmonarius is very sensitive to temperature change, since its primordial initiation is induced strictly by cold shock for a short period of time. Our prophase study had screened a EST encoding a MADS-box transcription factor (MADS-box TF), wich was up-regulated at 0h after cold stimuli. In this project, the MADS-box TF will be cloned and well identifed by corresponding protein sequence alignment, analysis of the expression levels, subcellular localization, TF activation experiment, and yeast two hybrid system. The results will provide us some important information on the identification of genes related with fruiting-body formation in P. pulmonarius, and will also help us to understand the mechanism of fruiting induced by temperature change in basidiomycetes.

冷刺激（胁迫）会诱导某些担子菌食用菌的子实体形成。秀珍菇对温度变化具有敏感性，短暂的冷胁迫能迅速诱导其子实体原基的形成。项目组在前期研究中筛选到了1条与食用菌冷刺激结实相关的MADS-box转录因子基因的EST序列。Real-time PCR研究显示该基因在秀珍菇冷刺激早期被诱导表达。本项目将在已有研究的基础上克隆该基因，通过序列分析、表达分析、亚细胞定位、转录因子激活实验、酵母双杂交等试验，初步鉴定基因功能。本项目的实施从基因水平、转录水平和蛋白水平鉴定和分析该基因，不仅为秀珍菇结实相关功能基因的研究提供重要的信息，而且指导其他菌类作物甚至其他真核生物的温度响应机制的研究也有重要的理论和实践意义。

冷胁迫会诱导某些担子菌食用菌的子实体形成。秀珍菇对温度变化具有敏感性，短暂的冷胁迫能迅速诱导其子实体原基的形成。项目组在前期研究中筛选到了1条与食用菌冷刺激结实相关的MADS-box转录因子基因的EST序列。前人研究显示MADS-box转录因子在真菌发育和胁迫响应过程中起到显著作用。本项目中，我们克隆了一个秀珍菇的MADS-box转录因子基因PpRLM1，其全长编码序列被证实。结构域分析显示PpRLM1蛋白在其蛋白N端包含两个相邻的高度保守结构域（MADS结构域和MFE2结构域）。进化分析显示PpRLM1蛋白属于真菌II型（MEF2型）MADS亚家族的RLM1分支，并与糙皮侧耳的KDQ32547.1蛋白具有最高的同源性。下游靶基因预测显示PpRLM1蛋白可能与秀珍菇基因组中32基因的启动子相结合，这些基因标注显示可能参调控与RNA加工处理，信号转导、氨基酸代谢等多个途径。亚细胞定位结果显示PpRLM1蛋白定位于细胞核中。酵母双杂交结果显示PpRLM1蛋白可以与5个蛋白互作，其中一条蛋白参与RNA的可变剪切。基因表达显示PpRLM1基因受冷胁迫诱导，在原基和子实体形成时期被强诱导，在菌柄、菌盖和原基表达量高与菌丝。这些结果显示PpRLM1蛋白通过参与调节RNA加工处理等多种途径在胁迫响应和子实体形成过程中扮演重要角色。