人卵母细胞线粒体DNA置换及其临床研究

由线粒体DNA突变所导致的疾病是一种母性遗传疾病，迄今没有十分有效的治疗方法。以Leber遗传性视神经病（LHON）为模型，利用人卵母细胞体外成熟和纺锤体移植技术建立线粒体置换的来源的胚胎干细胞系，探索避免线粒体疾病遗传和进行替代性治疗的新途径。通过建立受精来源的胚胎干细胞检测线粒体置换胚胎发育成个体的潜能，为避免线粒体DNA突变疾病的遗传进行初步的探索。在此过程中，利用活细胞荧光技术，mRNA芯片技术，荧光原位杂交技术检测不同纺锤体移植技术的安全性和有效性，为其应用于临床做进一步探索。线粒体置换来源的孤雌激活胚胎干细胞系对患者来说是没有免疫原性的，在其分化之后有可能为线粒体突变疾病患者进行细胞替代治疗。通过将ST来源的孤雌胚胎干细胞定向诱导分化后移到LHON模型小鼠的视网膜，检测其对受损视网膜神经节细胞的替代和修复，为人卵母细胞纺锤体移植技术应用于临床解除女性患者的病痛进行初步探索。

线粒体是真核生物的重要细胞器之一，是一种自身带有遗传物质（mtDNA）的半自主细胞器，也细胞内氧化磷酸化和形成ATP的主要场所,有细胞"动力工厂" 之称。线粒体病是遗传缺损引起线粒体代谢酶缺陷，使ATP合成障碍、能量来源不足导致的一组异质性病变。迄今为止，mtDNA引起疾病的治疗主要是支持性疗法，迄今尚无十分有效的治疗途径，如何阻断mtDNA疾病的遗传，同时寻找有效治疗mtDNA突变疾病的手段和尤为重要。mtDNA突变引起的疾病主要是通过母系遗传影响后代的，mtDNA基本上全部来自于卵母细胞。因此，为了避免mtDNA突变遗传给后代，在胚胎形成之前或者胚胎早期去除或者替换突变的mtDNA成为首选策略。目前已有研究分别在生发泡期、MII期以及原核期进行了相应的胞浆移植或核移植研究。此外，建立胞浆移植和核移植来源的胚胎干细胞系可以替换致病的线粒体，在不久的将来通过使这些胚胎干细胞分化和移植在一定程度上可以缓解患者的病情。.本研究主要通过利用人成熟卵子进行纺锤体移植（spindle transfer，ST），置换不同来源的卵子的胞浆（包含线粒体），获得置换mtDNA的成熟卵母细胞，并对发育和遗传等方面进行安全性评估，为置换mtDNA的卵母细胞进行临床应用奠定基础。构建具有发育潜能的纺锤体移植来源的的孤雌激活胚胎，以期通过胚胎干细胞建系和定向分化系统，获得mtDNA突变疾病的替代性治疗模型，为女性mtDNA突变患者进行替代性治疗提供珍贵的原材料。.通过纺锤体移植技术，我们利用直接注射法建立了建立高效的纺锤体移植技术，并抑制了在纺锤体移植过程中的卵子提前激活现象，提高了移植的效率，保证ST卵子的后期发育能力。同时检测了ST来源的受精和孤雌激活胚胎的具有较好的发育能力，表达多能性基因。通过检测ST来源的胚胎的基因组完整性，在一定程度上验证其安全性，为临床应用打好基础。此外，我们也发现，胞浆来源对ST胚胎后期发育具有决定性的影响。体外成熟（IVM）来源的胞质不能支持ST胚胎发育到囊胚，但是IVM来源的纺锤体却有能力发育到囊胚，这为我们下一步的应用提供了很好的基础数据。将孤雌激活的ST胚胎的内细胞团分离培养之后建立了一个类胚胎干细胞系，通过检测器多能性，基因表达谱和基因印记，我们发现ST来源的孤雌激活ES具有正常的表达的ES标记。虽然早期的基因组保持完整，但是随着传代延长出现了染色体